材料和试剂

mRNA-Seq 8样品制备试剂盒（Illumina，目录号：RS-100-0801）
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN，目录号：74903）
用于电泳的标准琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9539）

设备

生物分析芯片DNA 1000系列II（安捷伦）
凝胶电泳仪
Illumina基因组分析仪II（Illumina，型号：SY-301-1201）

软件

Bowtie（Langmead等人，，2009）
BEDTools套件（Quinlan和Hall，2010）
TopHat（Trapnell等人，，2009）
袖扣（Roberts等人，2011）
Velvet（Zerbino和Birney，2008）
CAP3（Huang and Madan，1999）
GMAP（版本2012-04-21）（Wu和Watanabe，2005）
Cistematic 2.5（ http://cistematic.caltech.edu/）
ERANGE软件（3.1）（Mortazavi等人，2008）
Medicago3.py：将Medicago注释导入cystematic的脚本（Boscari等人，2012）
Gff2knowngene.pl：将通用要素格式（GFF）格式转换为UCSC已知基因格式的脚本（Zenoni等人，2010年）
CASAVA（Illumina）
GenomeStudio（Illumina）

程序

从提取的RNA中分离Poly（A）mRNA，以制备具有mRNA-Seq 8样品制备试剂盒的无方向Illumina RNA-Seq文库。我们通过在室温下将切下的凝胶切片溶解在QIAquick凝胶提取试剂盒的QG缓冲液中来修改凝胶提取步骤，以避免在富含AT序列的表现下。
使用Bioanalyzer Chip DNA 1000系列II进行200bp的每个文库的质量控制和定量
在Illumina基因组分析仪II上产生36至44bp序列。在不同条件下获得了总计1.35亿的读数
M。 truncatula 基因组和剪接数据库序列比对是使用Bowtie生成的（ http：//bowtie-bio.sourceforge .net ）。
在Mt的3.0版本上进行读取的比对。 truncatula 基因组序列（ www.medicago.org ）。对于我们的分析，我们允许最多2个错配，并且与超过10个不同基因座匹配的序列被丢弃。基因组索引是用命令"bowtie-build -f medicago.fasta基因组"构建的，其中medicago.fasta是完整的Mt3.0 fasta文件。然后读取与命令"bowtie -v 2 -m 10 -k 11 -S genome reads.fastq output.sam"，其中reads.fastq是样品的原始测序读数，output.sam使用软件套件BedTools（< a target ="_ blank"href ="http://code.google.com/p/bedtools/"> http://code.google.com/p/bedtools/），以便分配每个阅读到外显子，内含子，UTR或基因间区。映射到外部外显子上的读数落在来自基因两端的3-kb流域内，促进对推定的未发现的外显子的研究。基因间读数表示落在该流域外的那些序列读数。程序ERANGE基于它们的比对定义潜在的新的表达簇;如果它们落入距离它们的3,000bp半径内（平均基因密度/2），则它们被归类为已知基因的新区段（外显子/UTR）。剩余的表达簇被标记为潜在的新基因
为了鉴定已知基因的潜在的新同种型，我们将所有读取重新映射到m。 truncatula 基因组（ http://tophat.cbcb.umd.edu/）由于我们的读取的短的长度，片段长度为16，并定义了已知基因的新同种型执行Cufflinks（ http://cufflinks.cbcb.umd.edu/）分析每个样品，标准参数，然后用Cuffcompare分析合并不同样品上确定的转录物。我们使用了由Medicago研究机构提供的最新基因组序列和注释（Mt3.5， http://www.medicago.org）/）。

为了鉴定新的转录区，我们使用未针对来自每个样品的Mt3.0序列进行作图的读取，使用Velvet程序（http://code.google.com/p/bedtools/）。

基因表达的评价用ERANGE软件（3.1）进行，可在 http：//woldlab.caltech获得。 edu/RNA-Seq 。 ERANGE需要Cistematic 2.5来执行RunStandardanalysis.sh。因此，开发了一个Python脚本（medicago3.py）来导入 M。 truncatula 参考序列（Mt3.0）和通用特征格式（GFF）中的注释到Cistematics Genomes sqlite数据库中，并且使用Perl脚本（gff2knowngene.pl）将GFF注释文件转换为knowngene.txt文件使用RunStandardanalysis.sh。 ERANGE报告每百万个映射读取的每千碱基外显子的定位读取的数目，测量每个基因的转录活性。为了获得基因表达的精确测量，不偏向映射到具有许多内含子的基因中的剪接点的读数，ERANGE考虑了与基因组或定制剪接点数据库映射的两个读数。 ERANGE比商业包装更受欢迎，例如来自Illumina的CASAVA和GenomeStudio平台，因为其开放性。这使我们能够适应和重用代码，用于我们自己的分析，具有比类似的封闭源商业软件包更大的灵活性

差异基因表达统计RNA-Seq。 ERANGE软件通过将读数分配给它们的原位并对它们计数来计算标准化的基因座位表达水平（称为RPKM）。在读取与几个位点同样良好的情况下，ERANGE将它们与它们最可能的起始位点成比例地分配（Mortazavi等人，2008）。给定基因座的RPKM值可以如下估计：
RPKM = N /（L * N <10> ⁹
其中N =给定基因座位处的作图读数数目，L =基因座位的估计长度（bp），N sub =总映射读数数目，以及10 ^{对应于1,000bp转录物多个1百万读数。使用R包q值（Storey，2002; Storey和Tibshirani，2003; Dabney等人，2010）对R工作环境测试每个基因无差异基因表达的零假设。基于使用基本R包统计对原始读取计数进行t检验所获得的p值计算假发现率。
方差=（1/RPKM1）+（1/RPKM2）
Stat =（log（RPKM1/N p.value =（1-pnorm（abs（Stat）））* 2
FDR的阈值为0.001，并且首先使用该过滤器选择基因然后基于倍数变化（FC）再次过滤差异表达的基因。 2.}

致谢

该协议改编自Boscari等人（2013）。

参考文献

Boscari，A.，Del Giudice，J.，Ferrarini，A.，Venturini，L.，Zaffini，A.L.，Delledonne，M.and Puppo，A。（2013）。苜蓿藜转录组在与中华根瘤菌共生相互作用期间的表达动力学：一氧化氮的作用？植物生理学 161（1）：425-439。

Huang，X。和Madan，A。（1999）。 CAP3：DNA序列装配程序 Genome Res 9（9）：868-877

Langmead，B.，Trapnell，C.，Pop，M。和Salzberg，S.L。（2009）。短DNA序列与人类基因组的超快速和记忆效率的比对 Genome Biol 10（3）：R25。

Mortazavi，A.，Williams，B.A.，McCue，K.，Schaeffer，L.and Wold，B.（2008）。通过RNA-Seq映射和定量哺乳动物转录组。 em> 5（7）：621-628。

Quinlan，A.R。和Hall，I.M。（2010）。 BEDTools：用于比较基因组特征的灵活的实用程序套件。生物信息学 26（6）：841-842。

Roberts，A.，Pimentel，H.，Trapnell，C.and Pachter，L。（2011）。使用RNA-Seq在注释的基因组中鉴定新的转录物 /em> 27（17）：2325-2329。

Trapnell，C.，Pachter，L。和Salzberg，S.L。（2009）。 TopHat：使用RNA-Seq发现剪接点生物信息学 25（9）：1105-1111。

Wu，T.D.and Watanabe，C.K。（2005）。 GMAP：mRNA和EST序列的基因组作图和比对程序。 Bioinformatics 21（9）：1859-1875。

Zenoni，S。，Ferrarini，A.，Giacomelli，E.，Xumerle，L.，Fasoli，M.，Malerba，G.，Bellin，D.，Pezzotti，M.and Delledonne，使用RNA-Seq在葡萄酿酒酵母发育过程中转录复杂性的表征。 Plant Physiol 152（4）：1787-1795。

Zerbino，D.R。和Birney，E。（2008）。天鹅绒：使用de Bruijn图表进行短时读取汇编的算法。 Genome Res 18（5）：821-829。