材料和试剂

多聚甲醛（PAF）（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
PBS（Sigma-Aldrich，目录号：P4417）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A3803）
聚-D-赖氨酸包被的载玻片（培养载玻片）（BD Biosciences，Falcon ，目录号：354632）
小鼠抗HisG单克隆抗体（Life Technologies，目录号：R940-25）
Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG（Life Technologies，目录号：A 110005）
Dako荧光封固剂（Dako，目录号：S3023）
原发性孢子囊。通过将miracidia转移至Chernin的平衡盐溶液（CBSS）并在26℃在常氧条件下保持24小时获得用于免疫细胞化学实验的巴西菌株（巴西菌株）（Yoshino和Laursen，1995）。然后，将100个初级孢子被与30nM重组生物脓毒素蛋白孵育1小时（Galinier等人，2013）。作为阴性对照，使用100个孢子囊，没有用重组生物溶解素处理
使用快速翻译系统（RTS 500 Wheat Germ CECF Kit）（5 PRIME，目录号2402500）在体外表达N末端His（6）标记的生物溶解素。
4％PAF（参见配方）
PBS/3％BSA（参见配方）
PBS/1％BSA（参见配方）
抗HisG抗体1：500（参见配方）
抗小鼠IgG 1：1,000（参见配方）

设备

盖片24×60mm（VWR International，目录号：631-1575）
BD BioCoat 聚-D-赖氨酸8孔培养物（Becton，Dickinson and Company，目录号：354632）
Eppendorf离心机（Eppendorf，型号：5810R）
摇摆式搅拌器（Fisher scientific，型号：10758995）
荧光共聚焦激光扫描显微镜（ZEISS，型号：LSM 700）

程序

收集100个孢子囊并转移到涂有聚-D-赖氨酸的培养载玻片上。
以800×g离心培养载玻片2分钟。
吸出上清液和固定孢子囊与200微升4％PAF在室温下1小时
离心培养幻灯片在800×g下2分钟，并抽吸上清液
用200μlPBS洗涤两次，并重复步骤4
加入200μlPBS/3％BSA，并在室温下无搅拌孵育2小时
离心培养幻灯片在800×g下2分钟，并抽吸上清液
加入200μl稀释在PBS中的抗His抗体，并在室温下以约12振荡/分钟的振荡速度孵育1.5小时。
在5分钟内用200μlPBS洗涤三次，每分钟振荡12次，洗涤，离心培养载玻片之间。
孵育孢子被与200微升Alexa面粉594结合的抗小鼠IgG稀释在PBS/1％BSA中的PBS在室温下45分钟，并保护幻灯片以每分钟12振荡的速度保护幻灯片。
重复步骤9.
在幻灯片上放置2滴Dako荧光封片剂，盖上盖玻片
在4°C下保持载玻片过夜，并在观察之前保护载玻片不受光照

图1.重组生物溶解素在曼氏血清中的免疫定位孢子囊。使用重组生物脓毒素（分别为A：阳性和B：阴性对照）处理孢子被，并使用抗His初级IgG和Alexa Fluor 594-偶联的二级抗体进行免疫染色。图像1和3在Nomarski光学显微镜下拍摄; 图像2和4，使用荧光共聚焦激光扫描显微镜（Zeiss LSM 700）

食谱

4％PAF
将4mg PAF溶解在100ml PBS中（伴随搅拌加热至60℃1小时）冷却的溶液可以过滤并储存在-20℃下
PBS/3％BSA 0.3mg BSA的10ml PBS溶液中
PBS/1％BSA
0.1mg BSA的10ml PBS溶液中
抗His抗体1：500
0.5μl抗his抗体仅在250μlPBS中
抗小鼠IgG 1：1,000
在250μlPBS/1％BSA中的0.5μl抗小鼠IgG

致谢

我们感谢Anne Rognon和Nathalie Arancibia的技术援助。我们感谢所有团队成员的建议和富有成果的讨论。这项工作得到了国家考古学中心（CNRS）和佩皮尼昂大学通过多米尼加大学（UPVD）的资助以及来自ANR（25390 Schistophepigen）的资助。资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发布或准备手稿方面没有任何作用。

参考文献

Galinier，R.，Portela，J.，Mone，Y.，Allienne，J. F.，Henri，H.，Delbecq，S.，Mitta，G.，Gourbal，B.and Duval，生物油蛋白，一种参与生物镜头免疫的新β成孔毒素 9（3）：e1003216。
Yoshino，T.P。和Laursen，J.R。（1995）。生产曼氏血吸虫女儿孢子囊从母体孢子囊保持在合成文化中胚胎（Bge）细胞。 81（5）：714-722。