材料和试剂

全血
RPMI 1640 Medium，GlutaMAX ^TM（Gibco ，目录号：61870）
DPBS，不含Ca 2+ 2+和Mg 2+ 2+ （Gibco ，目录号：14190-169）。
100x液体青霉素 - 链霉素（Gibco ，目录号：15140-122）
200mM L-谷氨酰胺溶液（Gibco ，目录号：25030-024）
胎牛血清（FBS）（Gibco ，目录号：10270106）
来自大肠杆菌O26：B6（10mg）（Sigma-Aldrich，目录号：L2654）的脂多糖
萤光黄黄色CH二锂盐（25mg）（Sigma-Aldrich，目录号：L0259）
DQ缓冲蛋白（1mg）（Molecular Probes ，目录号：D-12053）
Ficoll-Paque PLUS（General Electric Company，目录号：17-1440-03）
GMP重组人白介素-4（50μg，13×10 6 IU/mg）（Gentaur Molecular Products，目录号：04-GMPhuIL4-50μg）
将重组人GM-CSF（300μg，3.88×10 6个IU /瓶）（Gentaur Molecular Products，目录号：04-RHUGM-CSF-300μg）
IL-4
牛血清白蛋白馏分V（BSA）（Roche Diagnostics，目录号：10735078001）
FITC缀合的抗CD14（RMO52）（Beckman Coulter，目录号：IM0645U）
FITC缀合的抗IgG2a（7T4-1F5）（Beckman Coulter，目录号：IM0645U）
Perfect-Count Microspheres ^TM（Cytognos S.L.，目录号：CYT-PCM-50）
NaN 3（Sigma-Aldrich，目录号：71289）
FACS缓冲区（参见配方）
完整介质（见配方）
DQ-OVA（1mg/ml）（参见Recipes）
萤光黄（10mg/ml）（见配方）
rHuIL-4（500IU/ml）（参见配方）
rHuGM-CSF（800IU/ml）（参见配方）
LPS（1mg/ml）（参见配方）

设备

15 ml Ficoll-Paque PLUS
60-mm细胞培养板（Corning，目录号：15430166）
细胞计数管（BD Falcon管，圆底）（Becton，Dickinson and Company，目录号：352052）
离心机Heraeus Multifuge 3 L-R（Heraeus Holding，目录号：75004370）
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
BD FACSCalibur流式细胞仪（Becton，Dickinson and Company，目录号：342975）

软件

CellQuest Pro软件（Becton，Dickinson and Company，目录号：643436）

程序

用相同体积的DPBS稀释25ml血沉棕黄层（来自全血捐献的初始白细胞浓缩物）。
准备两个50毫升管用15毫升Ficoll-Paque PLUS。小心地将25ml稀释的血液样品在Ficoll-Paque PLUS上。重要：当分层样品不要混合Ficoll-Paque PLUS和稀释的血液样品
在18-20℃下以400×g离心25分钟。重要：刹车。
用移液管吸取稀释的血浆级分和透明的ficoll级分之间的白色界面，并将其转移到新管中。
用DPBS洗涤两次。
将沉淀重悬在5ml DPBS中
在细胞计量管中混合3μlFITC缀合的抗CD14抗体加上60μlDPBS和20μl细胞悬浮液。
在室温下孵育15-18分钟。
加入120μlDPBS，并通过流式细胞术使用Perfect-Count Microspheres ^TM根据制造商的说明计数CD14 ^{+单核细胞的数目。}
在60-mm培养板中，在不含血清的RPMI 1640培养基中，以1×10 6个细胞/ml将单核细胞平板，并允许在37℃下在5％CO 2中粘附2小时。
通过在DPBS中洗涤去除非粘附细胞。最终的粘附细胞群包含75-80％的单核细胞，如通过抗CD14染色的分离株的流式细胞术所证明的。
通过用1ml完全RPMI 1640培养基加上GM-CSF（800IU/ml）和IL-4（500IU/ml）补充单核细胞培养物产生单核细胞衍生的DC。
在第3天加入1ml完全RPMI 1640培养基加上GM-CSF（800IU/ml）和IL-4（500IU/ml）。
对于DC成熟，在第5天用新鲜的完全RPMI 1640培养基加上GM-CSF（800IU/ml）和IL-4（500IU/ml）替换旧培养基，并用5μg/ml刺激未成熟DC 48小时LPS。
收获漂浮在培养基中的非粘附细胞在15毫升管（在第5天为未成熟的DC;在第7天为成熟的DC）。加入2ml DBPS（37℃），冲洗并通过吸移收集粘附的细胞。用DPBS洗涤两次以上，并漂浮和贴壁细胞。离心并将沉淀重悬于500μl完全培养基中
准备两个细胞计管与60微升的完整培养基加4微升DQ-OVA（股票：1毫克/毫升）在37℃或0℃。
在37°C或0°C下用60μl完全培养基加6μlLucifer Yellow CH（原液：10 mg/ml）制备两个细胞计数管。
向每个细胞计数管中加入100μl细胞悬浮液（〜2×10 5个细胞/ml）。
保温时间：DQ-OVA为15分钟; 120分钟Lucifer黄色CH。用BODIPY FL染料（DQ-OVA）标记的OVA的荧光自淬灭，直到OVA通过甘露糖受体摄取并仅被内溶酶体蛋白酶降解。 Lucifer Yellow CH（LY）是一种亲水示踪剂，用于流体相巨噬细胞增多。 LY不降解，并且在高达6mg/ml的浓度下是无毒的。
通过加入1ml冷FACS缓冲液停止孵育
用冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次
使用流式细胞术分析未成熟DC（图1）和成熟DC的掺入的荧光。比较在37℃（特异性摄取）和在0℃孵育的细胞（非特异性摄取：被动扩散，...）下孵育的细胞的直方图和相应的平均荧光强度（MFI）。

图1.通过流式细胞术分析未成熟DC的内吞活性。评估单核细胞衍生的未成熟DC的内吞活性，测量荧光报告子DQ-OVA（受体介导的内吞作用）和萤光黄黄色CH（流体相内吞作用）的摄取。显示了代表性直方图。染料摄取对照显示为灰色。在每个直方图中指示不同荧光细胞群的中值荧光强度（MFI）。

食谱

FACS缓冲液（500ml）将5g BSA和0.5g NaN 3与500ml 1x DPBS混合过滤灭菌（0.45μm）
储存在4°C
完成媒介
RPMI 1640培养基，GlutaMAX ^TM
100μg/ml链霉素 100 IU/ml青霉素
2mM L-谷氨酰胺 10％热灭活的FBS GM-CSF 800 IU/ml
IL-4 500 IU/ml
储存在4°C
DQ-OVA（1mg/ml） 1mg/ml溶液可以通过将一个小瓶的内容物溶解在1ml DPBS中来制备。一旦重建，溶液应储存在-20°C，避光
萤光黄（10mg/ml） 10mg/ml溶液可以通过将一个小瓶的内容物溶解在2.5ml dH 2 O中制备。重建后，溶液应储存在4°C，避光保存
rHuIL-4（500IU/ml）可以通过将一个小瓶的内容物溶解在500μldH 2 O中制备500IU/ml溶液。一旦重建，溶液应储存在-80℃
rHuGM-CSF（800IU/ml）可以通过将一个小瓶的内容物溶解在2ml dH 2 O中制备800IU/ml溶液。一旦重建，溶液应储存在-80℃
LPS（1mg/ml）
1mg/ml溶液可以通过将一个小瓶的内容物溶解在1ml DPBS中来制备。重构后，溶液应储存在-20°C

致谢

该方案改编自先前公开的研究，Olivar等人（2013），并且由西班牙马德里部长办公室（Madrid，Spain）支持，通过授予PI10/1073从"Fondo de Investigaciones Sanitarias"（FIS-ISCIII），以及从2009SGR1490（Generalitat de Catalunya）到JMA。 JMA由SNS-Dpt的"研究者合并计划"赞助。 Salut Generalitat de Catalunya（Exp。CES06/012）。

参考文献

Olivar，R.，Luque，A.，Naranjo-Gomez，M.，Quer，J.，Garcia de Frutos，P.，Borras，FE，Rodriguez de Cordoba，S.，Blom，AM and Aran，JM 。补体调节剂C4b结合蛋白的α7βO同种型诱导树突状细胞中的半衰期，抗炎状态细胞。 190（6）：2857-2872。