图1.由HCT催化的苯丙素途径的两个酶反应。HCT（AEN02914）将p' - 香豆酰基-CoA转化为p' - 香豆酰基莽草酸（第一HCT-反应），其通过C3H（香豆酸3-羟化酶）转化为咖啡酰基莽草酸。 HCT将其进一步转化为咖啡酰辅酶A（第二HCT反应）。

材料和试剂

Tris碱（2-氨基-2-羟甲基 - 丙烷-1,3-二醇）（Biosolve，目录号：77-86-1）
二硫苏糖醇（DTT）（AG Scientific，目录号：C-1029）
聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）（Sigma-Aldrich，目录号：P-6755）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G-7893）
完全微型蛋白酶抑制剂混合片（Roche，目录号：04693159001）
Bio-Rad蛋白质测定（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A-7906）
p - 香豆酰基-CoA（TransMIT，目录号：C030）
莽草酸（Sigma-Aldrich，目录号：S-5375）
Caffeoyl shikimate（AnalytiCon Discovery GmbH，目录号：NP-00058）
辅酶A水合物（CoA）（Sigma-Aldrich，目录号：A-3164）
乙腈ULC/MS级（Biosolve，目录号：BIO-012041）
甲酸ULC/MS级（Biosolve，目录号：BIO-06914131）
液相色谱（LC）样品小瓶（Waters，目录号：186002639和2639531020）
冰
液氮
蛋白质提取缓冲液（参见配方）
反应混合物（参见配方）

设备

Nunc 96孔微孔板（无盖和平底孔）（Thermo Fisher Scientific，目录号：269787）
安全锁管2.0ml（Eppendorf，目录号：3706）
不锈钢外科手术刀刀片22号（Swann-Morton，目录号：0308）
砂浆（150×70mm; 700ml）（The Morgan Advanced Materials Company plc，目录号：12906-6a）
杵（150×36mm）（Haldenwanger，目录号：12906-2）
平衡（Mettler Toledo，型号：XP-105 Delta Range）
Vortex（IKA，型号：MS2 Minishaker L002050）
温度控制的台式微量离心机（Eppendorf，型号：5417R）
温度控制微孔板分光光度计（Molecular Devices，型号：Spectra Max 250）
Thermoblock（Eppendorf Thermomixer Compact）或水浴
UPLC-MS系统（在我们的情况下：连接到Thermo LTQ XL质谱仪（Thermo Fisher Scientific）或Synapt HDMS Q-Tof（WATERS）的Waters Acquity UPLC系统（WATERS））色谱分离在Waters Acquity BEH RP C18（2.1mm×150mm，1.7μm）柱（WATERS））
Ultrafreezer
可选：Qubit 2.0荧光计（Invitrogen）

软件

使用XCalibur 2.0软件（Thermo Fisher Scientific，Waltham）获取，分析和管理质谱信息

程序

蛋白质提取
1. 收集15厘米茎段，从1米高的芽出芽从杨树的树干使用剪枝的基地。如果使用1年树，可以使用主茎的部分
2. 立即将新鲜植物组织浸没在液氮中，并将样品储存在-80℃直到进一步使用
3. 在冰上孵育冻结的茎段几分钟，并在树干的一端在树皮上做一个小切口。树皮可以容易地从下面的组织剥离。形成层的一些部分可以粘附到剥皮的茎，但可以通过用手术刀轻轻地擦洗茎容易地去除。使用手术刀刮取木质部组织，确保刮取的组织立即收集在预冷的砂浆中（使用液氮保持材料在采样期间冻结）
4. 使用研钵和研杵将刮取的木质部组织研磨成细粉
5. 对于木质部总蛋白提取，在预冷的2ml管中称重〜100mg研磨的木质部组织并加入1ml冰冷的蛋白提取缓冲液。蛋白质提取缓冲液的组成在方案1结束时以配方1给出
6. 彻底涡旋并在冰上孵育1小时，每5-10分钟倒转管以防止沉淀
7. 在4℃下以20,000×g离心10分钟，并将上清液转移到新的预冷却的管中。保持所有样品在冰上。

使用Bradford方法的蛋白质定量（Bradford，1976）

准备校准曲线的BSA标准如下：

BSA（100μg/ml）的体积	水量	BSA浓度
0微升	240微升	0μg/ml
6微升	234微升	2.5μg/ml
12微升	228微升	5μg/ml
18微升	222微升	7.5μg/ml
24微升	216微升	10μg/ml
27微升	213微升	11.25μg/ml
30微升	210微升	12.5μg/ml

对于校准曲线，将240μl的每种标准品（上文）加入96孔平底微量培养板的单独孔中。所有测量一式三份
对于木质部总蛋白质样品的定量，在每孔中加入210μl水，并且一式三份地加入30μl蛋白质提取物稀释液。使用蛋白质提取缓冲液制备稀释液，稀释范围为5x至100x（取决于用于提取的植物材料的量）。
每孔加入60μlBio-Rad Protein Assay试剂，室温孵育5分钟
在板分光光度计上读取595nm处的吸光度（A 595）。
对于蛋白质浓度的计算，通过绘制BSA浓度（X轴）对A 595（Y轴）产生标准曲线。获得趋势线后，使用其对应的方程和蛋白质样品的吸光度来分辨未知浓度。趋势线的相关系数应该接近1.00（优选地大于0.97），并且蛋白质样品的所有测量的吸光度应当落入线性范围。
注意：
1. 图2显示了使用Bradford方法的蛋白质定量的实例。
2. 作为Bradford的替代品，可以根据制造商的说明书使用Qubit（Invitrogen），以准确和有效地定量蛋白质浓度。
  
  图2.使用Bradford测定的总蛋白质定量 1 通过从每个样品获得的值中减去空白的吸光度值计算标准化的吸光度。 ²将此值除以测定中使用的蛋白质提取物的体积，以计算最终浓度（在这种情况下，我们使用2μl）。

HCT活性测定
通过将对 - 香豆酰基-CoA和莽草酸转化为对 - 香豆酰基莽草酸（图1）来测量HCT活性。
1. 在制备酶反应之前，将木质部蛋白提取物的等分试样煮沸10分钟，因为煮沸的蛋白提取物将用作阴性对照。
2. 反应混合物在1.5ml管中制备，并含有100mM Tris-HCl pH 7,1mM DTT，100μM对香豆酰基-CoA，100μM莽草酸和10μg木质部蛋白提取物（配方2）。
3. 通过加入相应体积的蛋白质提取物开始反应。使用相同量的煮沸提取物的蛋白质作为阴性对照
4. 在30℃孵育30分钟。
  注意：为了进行深入分析，可以使用不同的时间点。
5. 通过煮沸样品5分钟终止反应。
  注意：煮沸后，将反应管置于冰上至少5分钟，然后快速旋转。这使得由蒸发和冷凝引起的盖子上的液滴回到主样品中，避免了最终产物浓度的变化。
6. 将总反应体积（40μl）转移到LC样品瓶中用于分析反应产物
产品识别和量化
将10μl水相进行反相LC-MS和LC-MS（Hoffmann等人，2003）。这里，具体条件可以根据使用的设备而不同。我们提供我们的内部条件优化以在连接到Thermo LTQ XL质谱仪的Waters Acquity UPLC系统上鉴定和定量 - 香豆酰基莽草酸。使用梯度洗脱在Acquity BEH C18柱（2.1mm×150mm，1.7μm）上进行色谱分离。
1. 流动相由含有1％乙腈和0.1％甲酸的水（缓冲液A）和含有1％水和0.1％甲酸的乙腈（缓冲液B）组成。柱温度保持在40℃，自动进样器温度保持在10℃
2. 在时间0min 5％（B），时间30min 50％（B），时间33min 100％（B）的梯度洗脱初始化期间施加350μl/min的流速。
3. 随后将洗脱液通过电喷雾电离（ESI）以负模式引导至质谱仪。
4. MS源参数如下：毛细管温度300℃，毛细管电压-24V，源电压3.5V，源电流100μA，鞘气流30，辅助气流20，吹扫气流5.质量范围设定在 m /z 95-500。
5. 反应产物对香豆酰基莽草酸的特征在于m/z 319，保留时间8.13分钟（反式异构体）9.64分钟（顺式异构体）和碎裂光谱（图3）。基于使用XCalibur's QuanBrowser的m/z 319的提取离子色谱图的曲线拟合和峰面积积分来定量化合物浓度。
  
  图3.对香豆酰基莽草酸（m/z 319）的MS ² 为了准确测量对香豆酰基莽草酸的质量，可以使用Synapt HDMS Q-Tof质谱仪（Vanholme et al。，2013b）。。

食谱

蛋白提取缓冲液
准备蛋白提取缓冲液如下：

库存解决方案	量/ 金额	最终浓度 n
100mM Tris-HCl pH7.5	2 ml	20 mM
100 mM DTT	1 ml	10 mM
100％甘油	1.5 ml	15％
PVPP	100 mg	1％
7x完全微型蛋白酶抑制剂	1.33 ml	1x
水到	10 ml

彻底混合。
注意：

将一片完全微型蛋白酶抑制剂溶解在1.5ml水中，制备7x储备溶液。
因为PVPP是不溶的，所以可能需要切割移液管吸头的末端以将蛋白质提取缓冲液添加到研磨的木质部材料中。

反应混合物
准备酶反应混合物如下：

库存解决方案	量	最终集中
500mM Tris-HCl pH7.0	8微升	100 mM
20 mM DTT	2微升	1 mM
2mM p-coumaroyl-CoA	2微升	100μM
2mM莽草酸	2微升	100μM
木质部蛋白提取物	x微博	10μg
水到	40微升

致谢

该方案由Vanholme及其同事在Vanholme等人（2013a）中简要描述。我们衷心感谢通过欧盟委员会第七框架内研究总司的资助授予协议N°211917（ENERGYPOPLAR），N°211868（NOVELTREE）和N°311804（MULTIBIOPRO）的程序（FP7/2007-2013），根特大学的Hercules程序Synapt Q-Tof（授予号AUGE/014）和多学科研究伙伴关系"根特大学的可持续经济生物技术"（01MRB510W）。 RV负责研究基金会佛兰德斯的博士后研究。

参考文献

Bradford，M.M。（1976）。利用蛋白质染料结合原理的快速灵敏的微克量蛋白定量方法。 Anal Biochem 72：248-254。
Hoffmann，L.，Maury，S.，Martz，F.，Geoffroy，P。和Legrand，M。（2003）。酰基转移酶的纯化，克隆和性质，其在苯丙素代谢中控制莽草酸和奎尼酸酯中间体。 a> J Biol Chem 278（1）：95-103
Hoffmann，L.，Besseau，S.，Geoffroy，P.，Ritzenthaler，C.，Meyer，D.，Lapierre，C.，Pollet，B.and Legrand，M。（2004）。羟基肉桂酰辅酶的沉默莽草酸/quinate hydroxycinnamoyltransferase影响苯丙素生物合成。植物细胞 16（6）：1446-1465
Vanholme，B.，Cesarino，I.，Goeminne，G.，Kim，H.，Marroni，F.，Van Acker，R.，Vanholme，R.，Morreel，K.，Ivens，B.，Pinosio，，Morgante，M.，Ralph，J.，Bastien，C.and Boerjan，W。（2013a）。具有罕见缺陷型等位基因（BRDA）的育种：天然黑猩猩 HCT 具有修饰的木质素的突变体作为案例研究。 New Phytol 198（3）：765-776。
Vanholme，R.，Cesarino，I.，Rataj，K.，Xiao，Y.，Sundin，L.，Goeminne，G.，Kim，H.，Cross，J.，Morreel，K.，Araujo， Welsh，L.，Haustraete，J.，McClellan，C.，Vanholme，B.，Ralph，J.，Simpson，GG，Halpin，C。和Boerjan， Caffeoyl莽草酸酯酶（CSE）是木质素生物合成中的酶 ce DOI ：10.1126/science.1241602。