材料和试剂

单元格
4％PFA
甲醇/丙酮1：1
TritonX100
一抗：来自Novus的53BP1 #NB 100-304兔子
第二抗体：山羊抗兔Alexa Fluor 488染料
PBS
甘氨酸
鱼明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G7041）
BSA
甲酰胺
Tris HCl，pH 7.4
端粒PNA探针（来自PANAGENE的TelC-Cy3，目录号：F1002-5）
DAPI
Mowiol 4-88试剂（Calbiochem ）
PBG（参见配方）
杂交混合物（参见配方）
封闭试剂（Roche Diagnostics，目录号：11096176001）（参见配方）
洗涤溶液I（参见配方）
洗液II（参见配方）

设备

玻璃盖片
12多孔板
金属热块
加湿室

程序

在玻璃盖玻片上生长细胞（例如 BJ正常人成纤维细胞）。
将盖玻片转移到12个多孔板。
用1x PBS简单冲洗。
用4％PFA，10分钟，RT或甲醇/丙酮1：1，2分钟，RT固定（取决于抗体，不影响FISH信号;使用甲醇/丙酮进行53BP1染色）。
用1×PBS清洗，3次，5分钟
仅对于PFA固定的细胞，用0.2％TritonX100在PBS中温育10分钟，然后用1x PBS洗涤3次，5分钟。
使用1x PBG，1小时，RT阻止。
孵育与一级PBG稀释的一抗，每个盖玻片50微升。孵育时间取决于抗体，大多数工作在1小时，RT，或在4℃过夜。（对于53BP1稀释1:200并在室温下孵育1小时）
用1×PBG，3次，5分钟洗涤
与在1x PBG中稀释的第二抗体孵育，45分钟，RT
用1x PBG洗涤两次，每次5分钟。
用1x PBS洗涤两次，每次5分钟。
用PFA 4％+ triton 0.1％，10分钟RT（如果你以前用甲醇/丙酮固定细胞，也用PFA）重新固定细胞。
与10mM甘氨酸在H 2 O中孵育30分钟，RT
用1×PBS清洗，3次，5分钟
准备杂交混合物，并将20μl放在载玻片上的每个盖玻片
小心地将盖玻片转移到滴上而不产生气泡。
将载玻片直接放在金属加热块上，在80℃，5分钟
在加湿室中杂交，2小时，RT
从幻灯片中取出盖玻片，并将其放回12孔板
用洗涤溶液I洗涤两次，15分钟。
用洗涤溶液II洗涤，3次，5分钟
用DAPI孵育，2分钟，RT
用1x PBS简单冲洗。
用mowiol装载。
将载玻片存储在4°C短时储存（2周）或-20°C。建议尽快分析荧光，以避免荧光团褪色

图1. ImmunoFish染色的人成纤维细胞的图像。 DAPI为蓝色，53BP1为绿色，端粒PNA探针为红色。

食谱

10×PBG（制备5ml等分试样并将其在-20℃下储存在50ml管中，免疫FISH的天将其稀释在1×PBS中）

鱼明胶
2％

BSA
5％

1x PBS
到卷
杂交混合物（总是准备新鲜）

甲酰胺
70％

封闭试剂
1x

Tris HCl pH7.4
10 mM

端粒PNA探针
0.5μM

H sub 2 O
到卷
10x封闭试剂
准备小份，并将其存储在-20°C
洗涤溶液I（250ml）（总是准备新鲜）

甲酰胺
175 ml

BSA 10％
2.5 ml

Tris HCl 1M pH7.4
2.5 ml

H sub 2 O
到卷
洗涤溶液II（350ml）（总是准备新鲜）

Tris HCl 1M pH7.4
35 ml

NaCl 5×m/v 10.5 ml

吐温20 10％
2.5 ml

H sub 2 O
到卷

致谢

F.d'A.d.F。实验室由FIRC（意大利人拉科尔卡），AIRC（意大利人协会），欧盟（GENINCA，合同号202230），HFSP（人类前沿科学计划），AICR（国际癌症协会研究），EMBO青年研究者计划和Telethon。

参考文献

Fumagalli，M.，Rossiello，F.，Clerici，M.，Barozzi，S.，Cittaro，D.，Kaplunov，JM，Bucci，G.，Dobreva，M.，Matti，V。和Beausejour，。端粒DNA损伤是不可挽回的，并导致持续的DNA损伤反应激活。 Nat Cell Biol 14（4）：355-365