材料和试剂

Falcon 50ml锥形离心管（Corning，Falcon ，目录号：352070）
1.5ml微量离心管（E＆amp; K Scientific Products，目录号：280150）
1.5ml不粘微量离心管（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM，目录号：AM12450）
0.2ml PCR管（GeneMate，目录号：3235-00-210IS）＆nbsp;
过滤移液管吸头（10,200,1,000μl）（VWR，目录号：89168-750,89140-936,89168-754）
制造商：Biotix，目录号：BT10XLS3，BT200，BT1250。
手套（Medline Industries，目录号：大号，MDS192086;中号，MDS192085;小号，MDS192084）
Qubit 0.5ml测定管（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q32856）
单边刀片（Personna，产品目录号：94-115-71）
无核酸酶的水（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM，目录号：AM9939）＆nbsp;
DNeasy PowerSoil套件（QIAGEN，目录号：12888-100）
引物515F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）
Primer 806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）
HotStar High Fidelity DNA聚合酶试剂盒（QIAGEN，目录号：202602）
Agencourt Ampure XP珠（Beckman Coulter，目录号：A63880）
Qubit dsDNA HS分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q32851）
乙醇200标准（Sigma-Aldrich，目录号：E7023-500ML）＆nbsp;
琼脂糖（生物技术来源，目录号：G01PD-500）
DNA凝胶加载染料
NucleoSpin凝胶和PCR清理试剂盒（MACHEREY-NAGEL，目录号：740609.250）
NaCl（Fisher Scientific，目录号：S271-1）
KCl（Fisher Scientific，目录号：P217-500）
Na 2 HPO 4（Fisher Scientific，目录号：S374-500）
KH 2 PO 4（Fisher Scientific，目录号：P285-500）
高压灭菌的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（〜100毫升/植物）（见食谱）

设备

96孔磁板（Alpaqua Engineering，目录号：A001219R）
1.5 ml管式磁力架（赛默飞世尔科技，产品目录号：MR01）
移液管（2.5,10,200,1,000μl）（Thermo Fisher Scientific，Finnpipette TM，产品目录号：4641010N，4641030N，4641080N，4641100N）
超声波清洗浴，40kHz（Branson，型号：Branson 1800，目录号：CPX-952-116R）＆nbsp;
解剖工具（剪刀和镊子）（剪刀：Bioseal，目录号：KI011 / 50;镊子：Integra LifeSciences，Miltex，目录号：6-184）
-80°C冷冻机
微量离心机（Eppendorf，型号：5417C）
Mini-Beadbeater-96高通量细胞破碎仪（Bio Spec Products，目录号：1001）
电泳凝胶单元（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704468）
Qubit荧光计（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q33226）＆nbsp;
PCR热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：T100 TM Thermal Cycler，目录号：1861096）。

软件

Python2版本2.7.12
R版本3.4.3

程序

下面列出的程序通常适用于各种条件，并已成功用于调查温室和田间的细菌和古菌群落组成（Edwards等，2015），以及跨环境扰动（桑托斯 - 麦德林2017）和植物发育阶段（Edwards等，2018）。
注意：

污染控制
由于引入的污染物可能会掩盖本协议生成的成分数据，因此务必遵守以下措施以尽量减少污染：
1. 总是戴手套。
2. 在开始每个主要步骤之前，用70％乙醇擦拭手和工作表面。
3. 避免将瓶子和管子留在环境中。
4. 使用过滤移液器吸头进行程序A（隔室分离），B（DNA提取）和C（PCR扩增）。 PCR后，您可以切换到无菌的未经过滤的提示。
用于存储示例
预处理的根在室温分离前应在4°C下保存不超过24小时。另外，在-80°C储存较长时间之前，应将各个隔室分开。冻结和解冻预处理的根会导致微生物细胞裂解，DNA可能扩散穿过隔室，因此降低分辨率。
1. 对于根际隔室，吸取步骤A4中产生的500μl土壤悬浮液到1.5ml微量离心管中，旋转（10,000×g，1分钟），除去上清液，并储存在-80℃。准备进行DNA提取时，在室温（〜23°C）下解冻样品，并在500μlPBS中重悬根际。
2. 对于根毛菌室，将在步骤A6中产生的500μl浓缩微生物悬浮液储存在-80℃下。准备进行DNA提取时，在室温（〜23°C）下解冻样品。
3. 对于内层隔室，使用灭菌的镊子将0.25g三次超声处理的步骤A7中的根转移到1.5ml微量离心管中并储存在-80℃。准备进行DNA提取时，在室温（〜23°C）下解冻样品。

根部相关微生物群的隔室分离
以下方案使用洗涤和超声处理步骤的组合来分离根系相关微生物群的根际，根际和内部层部分。这种方法已成功地用于收集组成不同的群落，这些群落含有在每个这些空间区域中富集的微生物（Edwards等人，2015年）。用于分离根毛菌的方案基于由Lundberg等人开发的用于内部球菌细菌分离的方法（2012）。由于Lundberg等人（2012）详述的原因，该方法利用浴超声波发生器去除rhizoplane中的微生物群，并避免次氯酸盐处理。由于来自根毛菌样品的DNA产量较低，所以这些序列在PCR扩增后会表现出更高的变异性，并且可能需要额外的重复才能得出统计学上显着的结论。应该指出的是，隔室解剖方案不能确保完全纯化来自相邻隔室的污染物，尤其是在它们在空间上重叠的情况下，但是尽管存在这些限制，该方案已经被证明对于总体组成特征的研究是有效和可再现的（Edwards ，2015; Santos-Medellin ，2017; Edwards 等，2018）。所有步骤在视频1中都有详细的说明。
1. 使用手套，通过牢固抓住枝条并将根系慢慢地拉出地面来收获水稻（图1A）。在幼苗的情况下，小心铲根，以避免撕裂组织。
2. 大力摇动根部以除去松散的土壤，只留下土壤层牢固地附着在根部。这层构成了根际隔室（图1B）。
3. 使用火焰灭菌剪刀，在根 - 芽接头正下方切下约5厘米的根（红色方框图1B和1C），并将组织置于灭菌的50毫升Falcon管中，用15毫升高压灭菌的PBS溶液。对于盆栽植物，避免直接在内壁附近收集根部。
4. 将根部涡旋15秒以混合PBS溶液中的根际部分（图S1 ）。保存得到的土壤悬浮液进行DNA提取（步骤B1）。
5. 使用火焰消毒镊子，将根转移到新的50毫升猎鹰管。通过加入20ml新鲜PBS彻底清洗根部，以最大速度涡旋15秒并丢弃PBS。重复这些步骤共进行三次洗涤（图1D）。如果有土壤残留在管子底部，请执行额外的清洗步骤，直到看不见土壤。
  
  图1.微生物组学研究的根收获和加工A.水稻根从土壤中拔出。 B.大力摇动稻谷以除去松散的土壤。红色框表示用火焰消毒剪刀约5厘米的根部切割。 C.将水稻根部分收集到50ml Falcon管中用于室分离。牢固附着在根上的土壤层构成了根际。 D.用无菌PBS溶液彻底清洗后的水稻根部。
6. 通过在50-60Hz下超声处理根部30秒来分离根茎分隔室，并将超声处理的微生物的10ml PBS转移至新管中（图S1 ）。将1.5ml微生物悬浮液加入到1.5ml微量离心管中，以10,000g×g离心1分钟并弃去1ml上清液。加入1ml微生物悬浮液，旋转（10,000×g，1分钟），并丢弃1ml。重复这些步骤再进行三次离心。通过涡旋（15秒）重新悬浮沉淀，并保存浓缩的微生物悬浮液进行DNA提取。
  注意：根据采样的根材料数量，颗粒可能会或可能不可见。
7. 加入足够的新鲜PBS以50-60Hz完全覆盖根部并超声处理30秒。丢弃PBS并再次重复此步骤。三次超声波处理的根构成了内部空间隔间（图S1） ;）。
DNA提取
使用DNeasy PowerSoil试剂盒从基因相关群落中分离基因组DNA。每个隔室的输入如下：
1. 对于根际隔室，将500μl步骤A4中产生的土壤悬浮液加入PowerBead试管中。
  注意：应避免大颗粒，这些颗粒会阻止土壤悬浮液吸入移液管吸头。如果移液器吸头堵塞太大而无法继续，请取出新的移液器吸头。重复该过程直至成功。
2. 对于rhizoplane隔间，将500μl步骤A6中产生的浓缩微生物悬液转移到PowerBead试管中。
3. 对于内层隔室，使用灭菌镊子将0.25g三次超声处理的步骤A7中的根转移到PowerBead管中。通过在PowerBead管中用包含石榴石颗粒的根部打碎珠粒1分钟来预均质化内部球体。
将样品添加到PowerBead管后，按照PowerSoil套件协议进行以下调整：
1. 加入Solution C1后，PowerBead试管可以使用珠磨机搅拌2分钟而不是涡旋10分钟。
2. 用30μlSolution C6洗脱最终产物，而不是100μl。
16S rRNA扩增
对于文库构建，该方案使用引物515F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）扩增16S rRNA基因的V4区域。 Illumina测序的引物设计遵循Caporaso等人（2012）中描述的方法，不同之处在于正向和反向引物均被条形码化（图2）。通过对每个样品使用独特的条形码组合，这种双重索引策略使我们能够将大量文库与有限数量的引物进行多重复合。正向引物的完整序列可以在此 GitHub页面和可以在此 GitHub页面上找到反向引物。我们建议使用24个样品组，其中所有反应共用相同的条形码515F引物，但具有独特的806R条形码。此外，为每个单独的反应运行阴性对照来检测任何潜在的污染都很重要。

图2. 16S V4区域扩增子的示意图A.扩增前的基因组区域。引物结合位点是蓝色的，数字对应于引物结合的16S rRNA基因内的位置。 B. PCR扩增后的扩增子。 FBC代表向前条形码，RBC代表反向条形码。 C.扩增子的测序策略。注意，在测序中使用三种定制引物：从位置515开始的正向读数的引物，从位置806开始的反向测序读数的引物和用于反向条形码的引物。正向引物序列和反向引物序列可以在GitHub上找到。
1. 对于一组24个反应和24个阴性对照，使用以下配方制备主混合物：
2. 将20.5μl主混合物分装到每个PCR管中。
3. 添加2.5μL相应的10μM条形码806R引物到每个管中并通过移液充分混合。
4. 将11.5μl的每个反应分装到新的PCR管中作为阴性对照。＆nbsp;
5. 加入1μl相应的模板至剩余的11.5μl
6. 盖住管子并旋下。
7. 运行下面的触地PCR程序：
  初始变性：
  95°C，5分钟
  7个循环，每个循环的退火温度降低2°C：
  95°C，45秒
  65°C，1分钟（-2°C /循环）
  72°C，1:30
  30个周期：
  95°C，45秒
  50°C，30秒
  72°C，1:30
  最后的延伸：
  72°C，10分钟
  暂停：
  4°C，∞
  注意：如果用户正在经历较高的样本变异，则PCR步骤中可能会产生噪音。地球微生物项目已经建立了协议其中3个独立的PCR在样品之间进行并随后汇集以最小化变异。
凝胶
1. 加入1μlPCR产物至5μl凝胶上样染料（1x）。
2. 在120V的1％琼脂糖凝胶上运行样品20分钟。
3. 确认正确的扩增（预期的条带大小约400bp长）和阴性对照中没有污染。
PCR清理
1. 从4°C取出珠子并使其达到室温（〜23°C）。
2. 准备一批70％的乙醇溶液（500μl/反应）。
3. 将9μlPCR产物等分至新的0.2 ml试管中。
4. 加入5.4μl（0.6体积）的Ampure XP珠粒，通过移液混合，并且在室温（〜23℃）下孵育5分钟。我们发现0.6倍体积的AMPure珠与PCR产物是正确的比率，以除去引物二聚体和未使用的引物，同时使PCR产物保持完整。此协议的用户可能需要进行实验以确保此比例也适用于他们的实验。
5. 将试管转移到磁板上静置2分钟。
6. 。小心地取出已清除的溶液而不会干扰珠子。
7. 将管保持在磁板上，加入200μl70％乙醇，孵育30秒，然后用移液管移除。重复此步骤再进行两次乙醇洗涤。为了最后的洗涤，从底部去除所有乙醇。
8. 将试管保持在磁板上，风干2分钟。注意不要过度干燥珠子，因为这会阻止珠子在步骤E9中重新悬浮。
9. 取下磁板上的平板，加入50μl无核酸酶的水，并通过上下移液重新悬浮珠子。
10. 将管放回磁板并孵育1分钟。
11. 将35μl洗脱液转移至新管中。
扩增子文库的量化
使用Qubit dsDNA HS分析来测量纯化文库的浓度：
1. 为标准设置两个测定管，每个样品量化一个。确保不要标记管的一侧，因为这可能会干扰样品读取。
2. 对于每个管，通过混合199μl的Qubit缓冲液和1μl的Qubit Working Solution来制备200μl的Qubit Working Solution。不要将工作溶液混入玻璃容器中，这一点很重要。
3. 对于标准品，将190μl工作溶液分装到0.5 ml分析试管中，加入10μl相应标准品，并通过涡旋混合。
4. 对于样品，将195μl工作溶液等分至0.5ml测定管，加入5μl相应样品，并通过涡旋混合。
5. 在室温下孵育2分钟。
6. 在Qubit荧光计上选择dsDNA高灵敏度分析，阅读标准，并运行每个样品。典型的DNA浓度范围从0.5到2.0 ng /μl。
扩增子文库的汇集
1. 每个MiSeq测序运行多个〜150个文库。如果需要进行多个测序运行，请在测序运行中随机化文库以避免批处理效应。
2. 基于获得的浓度范围，确定要汇集的DNA的目标量。旨在每个样本至少5 ng的DNA。
3. 对于每个文库，通过将目标DNA量除以样品浓度来计算体积需求。
4. 将这些文库合并到一个不粘核糖核酸酶1.5毫升微量离心管中。
5. 避免吸液量低于1μl。如果某些样品过于集中，请在合并之前对其进行预冷。
图书馆集中
1. 从4°C取出AmpureXP微珠并使其达到室温。
2. 准备一批新的70％乙醇溶液。
3. 将1.8体积的Ampure XP珠粒加入到合并的文库中，通过移液混合，并且在室温下孵育5分钟。 1.8倍的体积确保了珠子饱和后产品不会有任何损失。
4. 将试管转移到磁铁架上，静置2分钟。
5. 。小心地取出已清除的溶液而不会干扰珠子。
6. 将管保持在磁铁上，加入1.5毫升70％乙醇，孵育30秒，然后用移液管移出。重复此步骤再进行两次乙醇洗涤。为了最后的洗涤，从底部去除所有乙醇。
7. 当管子仍然在磁铁上，风干2分钟。
8. 从磁铁上取下试管，加入50μl无核酸酶的水，并通过移液重新悬浮珠子。
9. 将管放回磁铁并孵育1分钟。
10. 将清除过的洗脱液转移到新管中。
凝胶清理
1. 在120V的1.8％琼脂糖凝胶上运行浓缩的文库池40分钟。
2. 使用新的刀片，消除〜400 bp的带。
3. 使用NucleoSpin Gel和PCR Clean-up试剂盒纯化文库。
测序
1. 提交2 x 250 MiSeq测序的混合库。使用以下自定义测序引物：
  阅读1引物：TATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA
  阅读2入门：AGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT
  3'索引引物：ATTAGAWACCCBDGTAGTCCGGCTGACTGACT
2. 为低多样性样本包含一个PhiX控件。
序列分析
可以在 GitHub的。
1. 在电子表格中编译元数据
  1. 为每个样本指定一个唯一的标识符。这个标识符应该是唯一的，不仅仅是一个实验，而且也是所有以前的实验。标识符应该只包含字母数字和句点（“。”）字符。
  2. 创建条形码栏。
    每个样品应该有一个独特的条码
  3. 为与每个样品相关的实验变量创建额外的列。一些典型的实验变量是根室，植物发育阶段，植物基因型，地块位置，日期，年份和收集器。
    注：设计元数据表的详细协议可以在上找到地球微生物项目网站。
2. 从测序设备下载测序文件
  单个文件的下载可以通过FTP客户端或使用命令行工具（如Wget）来完成。
3. 解复用序列
  测序工具应提供4个fastq文件：两个读取文件（R1和R2）和两个索引文件（I1和I2）。
4. 构建完整的连续序列
  全长序列可以使用PANDAseq进行组装（Masella等人，2012年）。请注意，对于使用DADA2对OTU进行聚类，全长重叠群不是必需的（见下文）。
5. 集群序列并构建OTU表
  1. 如果使用QIIME进行聚类（Caporaso et al。，2010），则可以使用多种选项和算法。用户可能想要针对16S rRNA基因的数据库（闭合参考聚类）进行基于参考的聚类，或者用户可能想要执行初始OTU聚类。这种方法被称为闭合参考聚类。或者，用户可能更喜欢在这两种方法之间执行混合，其中序列首先是针对数据库引用的。在数据库中没有匹配的读取然后聚集在 de novo 中。这种方法被称为开放参考聚类。用户可以为一次读取定义相似性阈值，将其视为与数据库中的条目匹配。从历史上看，＆gt; 97％的序列同一性已被用作聚类序列到操作分类单位（OTU）的标准。通过使用NINJA-OPS流水线（Al-Ghalith等人，2016年），一种用于将序列封闭参考聚类成OTU的相对较新且极其快速的方法。 NINJA-OPS利用Bowtie的速度和记忆效率（Langmead and Salzberg，2012），将回读映射回连接的16S基因的合成基因组。这种方法可以在笔记本电脑上执行。
  2. 或者，用户可能更喜欢使用DADA2基于精确匹配来筛选序列（Callahan等人，2016a）。如果使用这种方法，则不需要在聚类之前构建全长连续序列。
6. 将分类分配给OTU
  存在多种算法来将分类法分配给OTU序列。如果使用闭基准OTU聚类，则不需要执行该步骤，因为数据库序列已经被分类（DeSantis等人，2006）。 QIIME默认使用UCLUST（Edgar，2010）算法进行分类分配，而DADA2使用RDP朴素贝叶斯方法（Wang等人，2007）将分类分配给序列。

数据分析

有关如何执行数据分析（包括R代码）的详细说明可以在 GitHub的。在本教程中，我们使用来自Santos-Medellin等人的数据（2017）来说明分析技术。

从数据集中去除质体和线粒体序列
1. 线粒体和质体是古代endosymbiosis事件的结果。线粒体和质体保留了它们自己的核糖体机制，因此一部分得到的序列将属于这些细胞器。这些读数不是根菌群的一部分，应在进一步分析前从数据集中删除。这并不是说细胞器读数没有用 - 这些读数可以用于定量目的（Edwards等人，2015年），但它们不应该被认为是微生物群的一部分。 >
2. 线粒体和质体OTUs可以通过其相关分类法在Family列和'Classoplast'列下搜索'线粒体'进行鉴定。
规范每个库的排序深度
虽然这些文库是以等摩尔浓度合并的，但是每个文库之间的测序深度可能会有几个数量级的差异。因此，有必要对数据进行规范化处理，以确保每个样本在分析中都具有同等的代表性。
存在一些用于标准化的方法。稀释是从OTU池中随机抽样直至达到所需深度的过程。值得注意的是，这种方法删除了用户获取的大部分数据。例如，如果用户有两个库 a 和 b ，并且每个库的深度 d 都是 d a = 100,000和 d b = 5,000时，用户可以选择稀有到5000个序列。这不会放弃来自 d b 的任何序列，但会从 d 中删除95％的数据> 一。使用这种方法可以丢弃具有低表示的OTU。相对丰度是一种将每个OTU的计数除以排序深度的方法，使得用户在每个库中的每个OTU的比例表示。这种方法充分利用了用户获得的所有数据。取决于具体分析，用户可能倾向于使用在高通量测序统计库例如edgeR（Robinson等人，2010）或DESeq（Anders和Huber，2010）中实施的替代方法。
确保元数据文件（也称为映射文件）中的样本顺序与OTU计数表中的样本顺序匹配。
从数据中删除低流行的OTUs
流行率低或不可重现的OTU可能会给数据集增加不必要的噪音。对于去除低丰度OTU没有特定的经验法则，但是之前使用的一个度量标准是去除至少5％样本中不存在的OTU（Callahan等人， 2016b; Edwards等人，2018年）。
Beta多样性图（图3A）
Beta多样性测量样品之间微生物群组成的差异。
1. 计算每个样本之间的成对不相似度。 Bray-Curtis，Jaccard和UniFrac（Lozupone and Knight，2005）的不相似性度量标准有适合这一任务的生态适宜度量标准。
2. 使用计算出的不相似度，执行主坐标分析（PCoA）。＆nbsp;
3. 绘制结果轴并根据感兴趣的因素对点进行着色。
Alpha多样性图（图3B）
Alpha多样性衡量每个样本中的多样性。
1. 计算每个样本的alpha多样性度量。流行的指标是香农指数，辛普森指数，物种丰富度和Faith的系统发育距离。
2. 绘制计算结果，比较感兴趣的因素。
门体水平分析（图3C）
1. 总结每个样本类型中每个门的平均表示。
2. 绘制结果。有很多方法可以绘制这些结果。在这里，我们选择使用堆积条形图显示数据。我们也只保留了10个代表性最高的门。
OTU差异丰度（图3D）
注意：细菌和古细菌OTU丰度的统计分布不遵循高斯分布，并且通常不能进行对数转换以适应正态分布。因此，不推荐假设正态分布的方法进行差异丰度检验。推荐使用可用的统计软件包（例如edgeR或DESeq），以正确建模OTU分布（McMurdie和Holmes，2014）。
1. 将非标准化计数数据加载到选择的统计数据包中。
2. 对测序深度进行标准化。
3. 模型样本水平和OTU水平分散。
4. 使用设计矩阵来安装模型
5. 进行差异丰度测试。
6. 绘制x轴平均丰度结果和y轴样品类型倍数变化的结果。
  
  图3.扩增子微生物组数据的实例分析A.主坐标分析显示使用Bray-Curtis差异的根室之间的微生物群落结构。每个点代表一个特定样品中的微生物群落。 B.使用两个常用度量标准，每个社区内的Alpha多样性。丰富度衡量每个样本中检测到多少独特的OTU，而香农熵则衡量社区中的随机性或不确定性。 C.数据集中10个最丰富的门的分布。我们展示了在门户层面进行分析时，站点之间存在类似的微生物分布间隔。 D.与根部土壤相比，根际和内部层间的差异丰富的微生物。每个点代表一个单一的微生物OTU。有色点代表其中一个比较中显着差异丰富的OTU。点的颜色代表浓缩的方向。差异丰度分析使用DESeq2进行。

笔记

应该指出的是，该方案已针对稻根进行了优化，并且不能保证上述超声处理程序将充分去除用于其他植物物种的rhizoplane微生物。同样，这种超声处理程序可能对其他植物物种过度侵入。应注意优化特定植物分类群的程序。

食谱

磷酸盐缓冲盐溶液（1L）
8克NaCl（Fisher Scientific）
0.2克KCl（Fisher Scientific）
1.44克Na 2 HPO 4（Fisher Scientific）
0.24克KH 2 PO 4（Fisher Scientific）
调整pH值到7.4

致谢

该协议改编自Edwards等人（2015年）。我们感谢多年来我们实验室的几位成员为本协议的制定做出了贡献，直接和间接地提供了有助于简化各个步骤的有益建议：Kelsey Galimba，Cassandra Ramos，Paul Tisher，John Jaeger，Eugene Lurie，Bao Nguyen，Natraj Podishetty和Zach Liechty。我们感谢Derek Lundberg和Jeff Dangl（北卡罗来纳大学教堂山分校）在发表之前（Lundberg et al。<2012>）善意提供了将它们从根际内分离出来的超声处理方法。我们感谢Srijak Bhatnagar和Jonathan Eisen在建立分析协议方面的帮助。 V.S.承认国家科学基金奖DBI-0923806和IOS-1444974以及美国农业部农业试验站授予编号CAD-XXX-6973-H的支持。 JE和CSM承认Elsie Taylor Stocking纪念研究奖学金和Henry Jastro研究奖学金的支持。 CSM承认加利福尼亚大学墨西哥研究所（UCMEXUS）/国立科技与技术研究院（CONACYT）和墨西哥教育协会（墨西哥）的支持。作者声明没有竞争利益。

参考

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Anders，S.和Huber，W。（2010）。序列计数数据的差异表达分析 Genome Biol 11（10）：R106。
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Callahan，B.J.，McMurdie，P.J.，Rosen，M.J.，Han，A.W.，Johnson，A.J。和Holmes，S.P。（2016a）。 DADA2：Illumina扩增子数据的高分辨率样本推断 Nat Methods 13（7）：581-583。
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