材料和试剂

组织
OCT
4％甲醛
PBS
Triton
山羊血清
BSA
一抗：来自Novus的53BP1 #NB 100-304兔子
第二抗体：山羊抗兔Alexa Fluor 488染料
Triton
甘氨酸
Mowiol 4-88试剂（Calbiochem ）
甲酰胺
Tris HCl，pH 7.4
端粒PNA探针（来自PANAGENE的TelC-Cy3，目录号：F1002-5）
吐温-20
DAPI
杂交混合物（参见配方）
封闭试剂（Roche Diagnostics，目录号：11096176001）（参见配方）
洗涤溶液I（参见配方）
洗液II（参见配方）

设备

玻璃片
金属热块
加湿室

程序

冷冻组织置于OCT中，无固定
需要时，切成所需的厚度（8-10微米），将载玻片干燥几分钟（通常是准备其他载玻片的时间）并在-80℃下再次冷冻。
染色的日子，解冻载玻片并在4％甲醛中固定20分钟
用PBS在室温下洗涤载玻片3×5分钟
用0.5％Triton的PBS在室温下透玻片5分钟
在室温下用PBS洗涤2次，每次5分钟
在用PBS + 1％BSA稀释的5％山羊血清中封闭60分钟
在4℃下孵育：53BP1 #NB 100-304（来自Novus的兔）在PBS，2.5％山羊血清，1％BSA中1:100。每张幻灯片使用60-80μl。
快速洗涤一次，在室温下用PBS洗涤3×10分钟
次要：在PBS + 1％BSA中的山羊抗兔（Alexa 488）（1/100）在室温下60分钟。
快速洗涤一次，用PBS RT洗3次，每次10分钟
用PFA 4％+ Triton 0.1％重新固定组织，RT 10分钟
与10mM甘氨酸在H 2 O中孵育30分钟，RT
用1×PBS清洗，3次，5分钟
准备杂交混合物，并直接30-50微升在样品上
将玻片小心地放在水滴上，不要产生气泡。
将载玻片直接放在金属加热块上，在80℃，5分钟
在加湿室中杂交，2小时，RT
从幻灯片中移除玻璃。
用洗涤溶液I洗涤两次，15分钟。
用洗涤溶液II洗涤，3次，5分钟
用DAPI孵育，2分钟，RT
用1x PBS简单冲洗。
用mowiol装载。
将载玻片存储在4°C短时储存（2周）或-20°C。建议尽快分析荧光，以避免荧光团褪色

图1. ImmunoFISH染色的小鼠海马组织的代表性图。 DAPI是蓝色的，53BP1是绿色的，端粒PNA探针是红色的。

食谱

杂交混合物（总是准备新鲜）

甲酰胺
70％

封闭试剂
1x

Tris HCl pH7.4
10 mM

端粒PNA探针
0.5μM

H sub 2 O
到卷
10x封闭试剂
准备小份，并将其存储在-20°C
洗涤溶液I（250ml）（总是准备新鲜）

甲酰胺
175毫升

BSA 10％
2.5 ml

Tris HCl 1M pH7.4
2.5 ml

H sub 2 O
到卷
洗涤溶液II（350ml）（总是准备新鲜）

Tris HCl 1M pH7.4
35 ml

NaCl 5×m/v 10.5 ml

吐温-20 10％
2.5 ml

H sub 2 O
到卷

致谢

方案的免疫荧光部分改编自Le等人（2010）。 F.d'A.d.F。实验室由FIRC（意大利人拉科尔卡），AIRC（意大利人协会），欧盟（GENINCA，合同号202230），HFSP（人类前沿科学计划），AICR（国际癌症协会研究），EMBO青年研究者计划和Telethon。

参考文献

Fumagalli，M.，Rossiello，F.，Clerici，M.，Barozzi，S.，Cittaro，D.，Kaplunov，JM，Bucci，G.，Dobreva，M.，Matti，V。和Beausejour，。端粒DNA损伤是不可挽回的，并导致持续的DNA损伤反应激活。 Nat Cell Biol 14（4）：355-365
Le，O.N.，Rodier，F.，Fontaine，F.，Coppe，J.P.，Campisi，J.，DeGregori，J.，Laverdière，C.，Kokta，V.，Haddad，E.andBeauséjour，电离辐射诱导的小鼠衰老标志物的长期表达是独立的p53和免疫状态。老化细胞 9（3）：398-409。