材料和试剂

猴肾细胞系CV-1细胞
由日本国家传染病研究所提供的MDCK繁殖的乙型流感病毒（B/Florida/4/2006和B/Malaysia/2506/2004）
最小必需培养基（MEM）（Sigma-Aldrich，目录号：M4655）
胎牛血清（FBS）（MP Biomedicals，目录号：2917054）
不含Ca 2+和Mg 2+的磷酸盐缓冲盐水（PBS）
Dulbecco's Modified Eagle's Medium F12（DMEMF12）（Life Technologies，目录号：11320-033）
乙酰化胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T6763）
吉姆萨染色溶液（Wako Pure Chemical Industries，目录号：079-04391）
甲醇（Nacalai tesque，目录号：21915-93）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9576）
特定病原体
单克隆抗体
MEM粉末（Nisshin EM，目录号：05901）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
MES（Wako Pure Chemical Industries，目录号：344-08351）
Fusion介质（参见配方）

设备

96孔细胞培养板（Corning，目录号：3596）
CO 2培养箱（37℃，5％CO 2）中培养。
光学显微镜

程序

（第1天）将包含10％FBS的100μlMEM中的CV-1细胞以2.5×10 5/ml /孔传代至96-孔板，并在CO 2 - 孵育器24小时
（第2天）将细胞用100μlPBS漂洗一次，在MO 2中在MO 2中用50μl病毒在MEM中吸附1小时，在CO 2培养箱中。
将细胞用100μlPBS漂洗一次，加入100μl包含0.2％BSA的DMEMF12，并在CO 2培养箱中孵育24小时。
（第3天）将细胞用100μlMEM洗涤两次
将包含2.5μg/ml乙酰化胰蛋白酶的100μlMEM中的细胞在CO 2培养箱中温育15分钟。
它们用100μlMEM洗涤两次。
将含有不同浓度的单克隆抗体（浓度为100,25,6.25,1.5,0.4和0.1μg/ml）的50μlMEM与不同孔中的细胞在CO 2培养箱中孵育30分钟。
吸去培养基后，加入100μl每种pH的融合培养基，然后在CO 2培养箱中孵育2分钟。
细胞用100μlMEM洗涤两次。
将细胞用100μl包含0.2％BSA的DMEMF12悬浮，并在CO 2培养箱中孵育3小时。
吸取培养基后，用100μl无水甲醇固定细胞30秒
吸入甲醇后，在室温下用100μl稀释的吉姆萨染色溶液（1ml/ml dH 2 O）将细胞染色30分钟。
在自来水上冲洗细胞后，通过显微镜观察细胞（图1）

图1.融合抑制测定中CV-1细胞的Giemsa染色。箭头显示多核巨细胞。

食谱

融合介质
将2x MEM与10mM MES和10mM HEPES混合调整到pH 5.0,5.5,6.0,6.5和7.0
混乱到1个MEM
高压灭菌

致谢

这项工作得到日本科学技术机构/日本国际合作机构，可持续发展科学和技术研究伙伴关系（JST/JICA，SATREPS）的部分支持（http://www.jst.go.jp/global/kadai /h2011_thailand.html）; 和日本科学促进会MY（＃23790660）的青年科学家助学金（B）。

参考文献

Yasugi，M.，Kubota-Koketsu，R.，Yamashita，A.，Kawashita，N.，Du，A.，Sasaki，T.，Nishimura，M.，Misaki，R.，Kuhara，M.，Boonsathorn，N 。，Fujiyama，K.，Okuno，Y.，Nakaya，T.and Ikuta，K.（2013）。人类单克隆抗体广泛中和乙型流感病毒 PLoS Pathog < em> 9（2）：e1003150。