材料和试剂

通过疫苗接种或针对特定病原体的自然感染免疫的人血液
人融合伴侣SPYMEG细胞（Medical& Biological Laboratories Corporation，Ltd，Nagoya，Japan的产品）
由RIKEN细胞库提供的Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞
MDCK增殖的乙型流感病毒（B/Florida/06/2004和B/Malaysia/2506/2006），由日本国家传染病研究所提供
不含Ca 2+和Mg 2+的磷酸盐缓冲盐水（PBS）
HetaSep（STEMCELL Technologies，目录号：07906）
Ficoll-Paque PLUS（GE，目录号：17-1440-03）
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，目录号：11995）
聚乙二醇＃1500（PEG）（Roche Diagnostics，目录号：00-783-641-00）
粪牛血清（FBS）（MP Biomedicals，目录号：2917054）
HAT supplement（Life Technologies，目录号：21060）
针对特定病原体的抗体
HT补充剂（Life Technologies，目录号：11067）
最小必需培养基（MEM）（Sigma-Aldrich，目录号：M4655）
乙醇（Nacalai Tesque，目录号：14713-53）
杂交瘤SFM（Life Technologies，目录号：12045-084）
HiTrap Protein G HP（GE，目录号：17-0404-01）
BM condimed（Roche Diagnostics，目录号：10-663-573-001）
肝素5000单位/5ml（Novo-Heparin，Mochida Phrrhaceutical）
FITC缀合的抗人IgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：109-096-097）
DMEM-FBS培养基（参见配方）
DMEM-HAT培养基（参见配方）
DMEM-HT培养基（参见配方）
PBS（请参阅配方）

设备

75cm 2细胞培养瓶（T-75烧瓶）（IWAKI PUMPS，目录号：3110-075）
15-和50-ml塑料管（BD Biosciences，目录号：352096和352070）
6-和10cm培养皿（IWAKI PUMPS，目录号：3010-060和3020-100）
6-，12-，24-，48-和96孔细胞培养板（IWAKI PUMPS，目录号：3810-006,3815-012,3820-024,3830-048和3860-096）
光学显微镜
荧光显微镜
CO 2培养箱（5％CO 2，37℃）中培养。
孵化器
蠕动泵（Perista BioMini Pump; ATTO Corporation）
Slide A Lyzer透析盒（MW = 10 K）（Thermo Fisher Scientific，型号：2160728）
烧杯
搅拌器
搅拌棒
Millex-HV过滤器单元0.45μm（EMD Millipore，型号：SLHVJ13SL）
2.5毫升注射器
浮动
21 G针
离心机（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：LC-121; TS-7转子）

程序

注意：每个离心步骤在室温下进行。

制备SPYMEG细胞（每10ml血液样品需要在T-75烧瓶中几乎汇合的SPYMEG细胞）
1. 储存在冷冻条件下的SPYMEG细胞解冻
2. 将细胞转移到15ml管中，加入10ml DMEM-FBS
3. 将细胞悬浮液以1,000rpm离心5分钟。
4. 吸出上清液，沉淀中的细胞用20ml DMEM-FBS悬浮
5. 将它们转移到T-75烧瓶中
6. 将细胞在CO 2培养箱中孵育直至细胞汇合
7. 在融合前一天向烧瓶中加入新鲜的10ml DMEM-FBS
8. 吸出培养基并在烧瓶中加入10ml DMEM
9. 通过轻轻敲击烧瓶，可以分离细胞。
10. 将细胞转移到50ml管中
11. 管以1,000rpm离心5分钟。
12. 除去上清液。
13. 将细胞沉淀用10ml DMEM悬浮。
14. 管以1,000rpm离心5分钟。
15. 吸出上清液。
16. 将细胞沉淀用10ml DMEM悬浮
外周血单核细胞（PBMC）的分离
1. 从接种的供体或患者抽取新鲜的10ml血液
2. 将血液收集在包含1滴肝素的15ml管中
3. 血液以1,000rpm离心5分钟。
4. 去除等离子体层。
5. 加入PBS至总量为10ml。
6. 加入3ml未稀释的HetaSep
7. 将血细胞轻轻混合并在室温下放置1小时
8. 小心地收集上层，并覆盖在15ml管中的5ml未稀释的Ficoll上
9. 将管在1,700rpm离心1小时。（制动器关闭）。
10. 除去上层，将浑浊的中间层转移到新的50ml管中
11. 在总体积中加入DMEM至多20ml
12. 将细胞轻轻混合并以1,700rpm离心5分钟
13. 除去上清液。
14. 加入20ml DMEM
15. 将细胞轻轻混合并以1,700rpm离心5分钟
16. 除去上清液。
17. 加入10ml DMEM，轻轻混合细胞
融合
1. 将在A16中制备的10ml SPYMEG细胞和在B17中制备的10ml PBMC溶液在50ml管中轻轻混合。
2. 混合细胞悬浮液在1,400rpm离心5分钟
3. 除去上清液。
4. 将0.6ml未稀释的PEG逐渐加入到细胞沉淀中，并将细胞轻轻搅拌（需要4分钟）。
5. 逐渐加入10ml DMEM，并将混合物轻轻搅拌（需要2分钟）
6. 加入10ml DMEM-FBS（不需要混合）。
7. 将管在1400rpm离心5分钟。
8. 除去上清液。
9. 加入10ml DMEM-FBS，轻轻混合细胞
10. 管以1,000rpm离心5分钟。
11. 除去上清液。
12. 加入10ml DMEM-HAT，轻轻混合细胞
13. 细胞溶液分成2个管
14. 向每个管中加入45ml DMEM-HAT
15. 将100ml细胞溶液接种在96孔板中的500孔（每孔200μl细胞悬浮液）中
16. 将板在CO 2培养箱中孵育
17. 将100μl培养基每3至4天更换为新的DMEM-HAT，直到融合细胞生长
筛选产生抗原特异性抗体的杂交瘤
1. 制备感染的MDCK细胞用于筛选。
  1. 在感染前一天，使用包括10％FBS的MEM在96孔板中以每孔2×10 4个细胞（每孔100μl）传代MDCK细胞。
  2. 将MDCK细胞用100μlPBS洗涤一次。吸入PBS后，MDCK细胞吸附50μl用MDCK细胞以0.1的MOI繁殖的B型流感病毒在CO 2培养箱中1小时。
  3. 向孔中加入100μlMEM
  4. 将板在CO 2培养箱中温育12小时
  5. 介质被移除。
  6. 将细胞用100μlPBS洗涤一次，并在室温下用200μl无水乙醇固定2分钟
  7. 将板空气干燥并在-20℃下储存直至筛选
2. 在D1中制备的固定MDCK细胞用在C16中制备的75μl融合细胞的培养基在37℃下吸附40分钟。
3. 将它们用100μlPBS洗涤三次，每次搅拌5分钟
4. 将平板用75μlFITC-结合的抗人IgG（1:500）吸附，并在37℃下静置50分钟。
5. 将它们用100μlPBS洗涤三次，每次搅拌5分钟
6. 在荧光显微镜下观察荧光阳性细胞
7. 将培养基产生荧光阳性细胞的杂交瘤孔加工成细胞克隆
克隆杂交瘤
1. 移取包括D7中的荧光阳性细胞的每个孔，直到细胞分离
2. 使用计数室计数细胞数。
3. 在96孔板中用DMEM-HT（每孔200μl）将细胞悬浮液调整至每孔1个细胞。
4. 将它们接种到96孔板中并在CO 2培养箱中孵育
5. 每3至4天将100μl培养基更换为新的DMEM-HT，直到细胞生长（使用光学显微镜检查细胞增殖）。
6. 再次进行筛选以选择如D1至D7中所述的抗原特异性杂交瘤克隆
7. 产生抗原特异性抗体的杂交瘤克隆传代至较大孔板（96孔，48孔，24孔，12孔板和6孔板和6cm培养皿），并最终在10cm培养皿。
人单克隆抗体的纯化
1. 制备10个10cm的包括DMEM-HT中的汇合杂交瘤的培养皿
2. 培养基更换为Hybridoma SFM
3. 将细胞在CO 2培养箱中培养直到杂交瘤细胞的一半死亡
4. 收集培养基并以5,000rpm离心30分钟
5. 根据制造商的说明使用蠕动泵通过IgG亲和柱（HiTrap Protein G HP）纯化单克隆抗体。
6. 纯化的抗体用针头填充在注射器中
7. 将抗体注射到透析盒中。
8. 将具有浮子的盒浸入装有1,000ml PBS的烧杯中并在4℃下搅拌2小时。
9. 改变1000ml PBS，并将该盒在4℃再次搅拌2小时。
10. 改变1000ml PBS，并将该盒在4℃下再次搅拌过夜
11. 收集盒中的抗体，并用0.45μm过滤器过滤
12. 测量抗体的浓度。
病毒中和测定
1. 在D1中所述的病毒中和测定前一天在96孔板中制备MDCK细胞
2. 将浓度为100μg/ml的抗体用MEM连续稀释4倍
3. 将30μl稀释的抗体或作为对照的MEM与30μl200焦点形成单位的病毒在CO 2培养箱中孵育1小时。
4. 用100μlPBS洗涤MDCK细胞，并用在CO 2培养箱中VII-3中制备的30μl混合物吸附1小时。
5. MDCK细胞用100μlPBS洗涤三次，并加入100μlMEM
6. 将它们在CO 2培养箱中温育12小时
7. 细胞用100μlPBS洗涤，并在室温下用200μl无水乙醇固定2分钟
8. 细胞被空气干燥。
9. 固定的MDCK细胞用75μl用于检测病毒抗原的第一抗体（小鼠血清感染乙型流感病毒，1:500）吸附，并在37℃下孵育30分钟。
10. 将它们用100μlPBS洗涤三次。
11. 将它们用75μlFITC-偶联的1号抗体的IgG抗体吸附，并在37℃孵育45分钟。
12. 它们用100μlPBS洗涤三次。
13. 在通过荧光显微镜观察的每个孔中对抗原阳性细胞计数（图1）
  
  图1.荧光显微镜观察到的荧光阳性或阴性细胞
14. 当用抗体处理的孔中的细胞数低于对照（用PBS处理）中的细胞数时，抗体被认为是中和性单克隆抗体。与对照相比，显示阳性细胞数至50％的MAb的最低浓度称为VN 50滴度。低VN 50抗体滴度意指MAb具有强中和活性

食谱

DMEM-FBS培养基（500ml）

DMEM
425 ml

FBS
75 ml
DMEM-HAT培养基（500ml）

DMEM
401 ml

FBS
75 ml

HAT补充
8 ml

HT补充
1 ml

BM约了
15 ml
DMEM-HT培养基（500ml）

DMEM
405 ml

FBS
75 ml

HT补充
5 ml

BM约了
15 ml
PBS（1000ml）

NaCl
8克

2 2
2.9克

KCl
0.2 g

KH ₂ PO ₄
0.2 g

dH 2 2 O 1000 ml

pH值未调整。
高压灭菌

致谢

这项工作得到日本科学技术机构/日本国际合作机构，可持续发展科学和技术研究伙伴关系（JST/JICA，SATREPS）的部分支持（http://www.jst.go.jp/global/kadai /h2011_thailand.html）; 和日本科学促进会MY（＃23790660）的青年科学家助学金（B）。

参考文献

Yasugi，M.，Kubota-Koketsu，R.，Yamashita，A.，Kawashita，N.，Du，A.，Sasaki，T.，Nishimura，M.，Misaki，R.，Kuhara，M.，Boonsathorn，N 。，Fujiyama，K.，Okuno，Y.，Nakaya，T.and Ikuta，K.（2013）。人类单克隆抗体广泛中和乙型流感病毒 PLoS Pathog < em> 9（2）：e1003150。