材料和试剂

纯化的HuMAb（IgG）
纯化抗原
2- [4-（2-羟乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）（Nacalai tesque，目录号：17514-15）
氢氧化钠（Wako Pure Chemical Industries，目录号：198-13765）
2mol/L氢氧化钠溶液（Nacalai Tesque，目录号：37441-45）
乙酸钠，无水（Wako Pure Chemical Industries，目录号：192-01075）
乙二胺-N，N，N'，N'-四乙酸二钠盐二水合物（EDTA 2Na）（Dojindo Molecular Technologies，目录号：345-01865）
聚氧乙烯（20）山梨糖醇酐单月桂酸酯（Wako Pure Chemical Industries，目录号：167-11515）
山羊抗人Fcγ（Jackson ImmunoResearch Laboratories INC。，目录号：109-005-008）
1-乙基-3- [3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）（Thermo Fisher Scientific，目录号：22980）
（NHS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：24500）。
乙酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：017-00256）
2-乙醇胺（Nacalai tesque，目录号：23405-42）
盐酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：080-01066）
氯化镁六水合物（Wako Pure Chemical Industries，目录号：135-00165）
氯化钠（Nacalai tesque，目录号：321319-45）
甘氨酸（Nacalai tesque，目录号：17109-35）
EDC/NHS溶液
0.5 M HEPES缓冲液（pH 7.4）（见配方）
0.5 M EDTA（pH 8.0）（参见配方）
20％（v/v）聚山梨酯20（参见配方）
10x HBS-E（见配方）
1x HBS-EP（参见配方）
400 mM EDC（见配方）
100 mM NHS（参见配方）
1 M 2-乙醇胺（pH 8.5）（参见配方）
50 mM NaOH（见配方）
10mM乙酸盐缓冲液（pH 4.0,4.5,5.0,5.5）（参见Recipes）
甘氨酸缓冲液10 mM（pH 1.8,2.0 2.2,2.4）（参见配方）
1 M NaCl（见配方）
3 M MgCl <2> （参见配方）

设备

用于SPR分析的仪器，例如Biacore T200（GE）或ProteOn XPR36（Bio-Rad Laboratories）
传感器芯片（具有可用于胺偶联反应的羧基），例如用于Biacore T200的系列S传感器芯片CM5（GE，目录号：BR-1005-30）或ProteOn GLM传感器芯片（Bio- Rad Laboratories，目录号：176-5012）用于ProteOn XPR36
真空泵
0.22μmPES PLUS底部过滤器（IWAKI PUMPS，目录号：8024-045）
0.22μmMillex-GV注射器过滤单元（Millipore，目录号：SLGV033RS）
20ml注射器（Thermo Fisher Scientific，目录号：SS-20ESZ）
离心机
1.5ml离心管（Ina-optika corporation，目录号：CF-0150）
Spectra/Por 3透析试剂盒（SPECTRUM LABORATORIES，目录号：132720T）
搅拌棒和搅拌器
紫外光谱仪
pH计

程序

试剂和样品的制备
1. 制备试剂（HBS-EP缓冲液，400mM EDC，100mM NHS，50mM NaOH，1M 2-乙醇胺-HCl，甘氨酸缓冲液和乙酸盐缓冲液）。在4℃下在搅拌器上在1L HBS-EP缓冲液中用300ml dH 2 O和透析抗原洗涤透析膜至少8小时。 HBS-EP缓冲液应更换为新鲜的一次，间隔至少8小时注意：
  1. 抗原溶液和运行缓冲液之间的折射率不平衡将导致高背景信号（称为体效应）并干扰SPR分析。
  2. 抗原的浓度推荐为5μM或更高，因为弱抗原 - 抗体相互作用的解离常数有时达到10-6M范围，并且在这种情况下SPR实验需要相对高浓度的抗原，即为5μM以上。
2. 通过紫外线UV光谱或标准BCA分析确定抗原浓度
抗人Fcγ在传感器芯片上的固定化
1. 将传感器芯片装入SPR仪器。
  注意：在处理仪器的所有步骤中，应遵循仪器的手册。
2. 将1 L HBS-EP缓冲液设置为运行缓冲液。
3. 通过用10mM乙酸盐缓冲液稀释制备300μl配体溶液：100μg/ml四种不同pH值（4.0,4.5,5.0和5.5）的抗人Fcγ溶液。
4. 注射配体溶液并确定观察到最高反应水平的最佳pH条件（图1a）注意：当几乎没有或没有差异时，选择较高的pH以避免配体变质并促进偶联反应。实际上，选择pH 4.0或4.5用于抗人Fcγ的固定，尽管您应该为您的SPR系统确定。
5. 通过注入30μl的50mM NaOH初始化芯片表面
6. 通过注射70μl1：1 EDC/NHS混合物激活芯片表面
7. 注射抗人Fcγ溶液并检查基线增量。重复注射，直到增量变得无法检测。
  注意：在该步骤中，抗人Fcγ应尽可能固定。通常，约。 8,000（共振单位，RU）增量。
8. 注入70μl的1M 2-乙醇胺-HCl溶液以阻断传感器芯片上剩余的活性羧基注意：如果您想在此步骤中停止实验，请将传感器芯片从仪器中取出，并在4°C下在HBS-EP缓冲液中储存，以防止干燥。
检查抗原-MAb相互作用和设计实验。
1. 通过用HBS-EP缓冲液稀释制备1ml的1μg/ml MAb溶液注意：原始MAb溶液不应包括任何干扰MAb和抗人Fcγ之间相互作用的试剂，例如pH 2.4或更低的100mM甘氨酸缓冲液。
2. 注射目标MAb，并检查固定量作为基线水平的增量注意：对于SPR分析，较小的固定量是优选的，只要对抗原的反应给出足够的信号。
3. 注入30μl不同pH值1.8,2.0,2.2和2.4的10mM甘氨酸溶液。通过检查基线水平的减量，确定MAb剥离条件（pH，注射时间，注射次数，基线稳定所需的时间）。
  注意：基线水平应接近MAb固定前的水平。实施条件的实例如下：注入30μl10mM甘氨酸pH2.0三次，并通过运行缓冲液洗涤600秒作为基线稳定期。
4. 通过用HBS-EP缓冲液稀释制备1ml1μM抗原溶液
5. 通过在室温下以15,000×g离心5分钟澄清抗原溶液。
6. 注射60μl抗原溶液并检查SPR反应。
  注意：尽管响应曲线是可识别的，但最小响应级别为1 RU或更小，但它显然取决于基线稳定性，换句话说，SPR系统的稳定性。
7. 通过注射60μl的1M NaCl或3M MgCl 2来确定抗原剥离条件。
  注意：作为其他选择，您可以用甘氨酸缓冲液去除整个抗原-MAb，并从MAb固定化步骤重试。根据实验设计，抗原剥离条件不是必需的。
8. 准备1毫升至少5种不同浓度的抗原溶液，用HBS-EP缓冲液按1：1连续稀释
9. 考虑以下几点确定实验设计。
  1. MAb固定条件。
  2. 抗原溶液的注射期和洗涤期注意：
    1. 它们分别对应于缔合和解离期的长度。设置适当的值以获得显着的信号电平和足够的曲率。
    2. 在一些情况下，抗原从MAb非常缓慢地解离，然后我们需要设置非常长的洗涤期。当没有观察到解离时，尝试降低MAb的固定水平。
  3. 抗原剥离条件。
  4. 空白实验设计：无MAb固定和/或注射HBS-EP缓冲液替代抗原溶液
  5. 单个流路的设置。
    注意：通常，SPR系统有多个流路用于空白实验和一次检查多个MAbs。
曲线分析
1. 收集的实验数据根据SPR系统的供应商提供的拟合算法进行分析（例如，参见图1c）。通常使用1：1 Langmuir拟合模型注意：检查软件提供的卡方值和质量指数。
  
  图1. SPR实验的实际示例 t 。
  1. 测定抗人Fcγ的胺偶联固定的pH值。 pH 4.0显示最高的反应，然而，它也显示出流平的迹象。然后，我们在这种情况下选择pH 4.5。打开的箭头和闭合的箭头分别表示注射抗人Fcγ溶液的开始和结束点。
  2. 通过抗人Fcγ和人MAb之间的相互作用将MAb固定在传感器芯片上。打开的箭头和闭合的箭头分别表示注射人MAb溶液的开始和结束点。基线水平（在这种情况下，约10RU）的增量表示MAb的固定量
  3. 对于B型流感血凝素（HA）和人抗HA抗体之间的相互作用的代表性SPR反应。打开的箭头表示HA溶液的注射，并对应于缔合期。闭合箭头表示最终注射的结束，并对应于解离期的开始。通过1：1 Langmuir拟合模型获得的拟合曲线也用灰线显示

笔记

通常，在集成系统中进行SPR分析，其中设备（传感器芯片，缓冲瓶，样品管等），实验设计，分析算法以及甚至试剂都供应用于使用该仪器。我们在这里描述了抗原-MAb相互作用分析的SPR实验的一般程序。请按照您的仪器手册和/或联系供应商以获得更详细的协议

食谱

0.5M HEPES缓冲液（pH7.4）（500ml）将59.6g HEPES粉末与400ml dH 2 O混合用NaOH调节pH至7.4 将dH <2> O添加到500ml
用0.22μm底部过滤器和真空泵过滤
0.5M EDTA（pH8.0）（500ml）将93.1g的EDTA缓冲液与400ml dH 2 O混合。
用NaOH调节pH至8.0 将dH <2> O添加到500ml
用0.22μm底部顶部过滤器过滤并在室温下贮存
20％（v/v）聚山梨醇酯20（500ml）将400ml dH 2 O加入到100ml聚氧乙烯（20）脱水山梨糖醇单月桂酸酯中
10x HBS-E（500ml）混合100ml 0.5M HEPES缓冲液，pH 7.4
30ml 0.5M EDTA，pH8.0 44克NaCl
将dH <2> O添加到500ml
1x HBS-EP（4 L）
10x HBS-E缓冲液400ml
将dH <2> O添加到4 L
用0.22μm底部过滤器和真空泵过滤加入1ml 20％（v/v）聚山梨醇酯20
400mM EDC（10ml）将750mg EDC溶解在10ml dH 2 O中分配200微升到1.5毫升管，并储存在-20°C
100mM NHS（10ml）将115mg NHS溶解在10ml dH 2 O中分配200微升到1.5毫升管，并储存在-20°C
1 M 2-乙醇胺（pH8.5）（50ml）将3.0ml 2-乙醇胺用dH 2 O稀释至40ml
用HCl
调节pH至8.5 将dH <2> O添加到50ml
分配1毫升到1.5毫升管和存储在4℃
50mM NaOH（10ml）用dH 2 O至10ml稀释250μl2M NaOH溶液将1ml分配到1.5ml管中并在室温下保存
10mM乙酸盐缓冲液（pH4.0,4.5,5.0,5.5）（各50ml）将8.2g乙酸钠与100ml dH 2 O混合以制备1M乙酸盐/Na 用100ml dH 2 O稀释5.7ml乙酸盐以制备1M乙酸盐用dH 2 O稀释100倍制备10mM乙酸钠和10mM乙酸钠。
通过混合10mM乙酸盐和10mM乙酸盐-Na调节pH 用0.22μm过滤器和注射器过滤
甘氨酸缓冲液10mM（pH 1.8,2.0 2.2,2.4）（各50ml）将0.30g甘氨酸与dH 2 O混合并将dH 2 O加至200ml
将50ml甘氨酸溶液分配到100ml烧杯中
加入HCl调节pH值
将dH <2> O添加到100 ml
用0.22μm过滤器和注射器过滤
1 M NaCl
将2.9g NaCl与dH 2 O混合至50ml
用0.22μm过滤器和注射器过滤
3 M MgCl 2
用dH 2 O混合30.5g MgCl 2和6H 2 O，并将体积调节至50ml br/> 用0.22μm过滤器和注射器过滤

致谢

该方案通过参考Biacore T200（GE-Healthcare）和ProteOn XPR36（BIO-RAD）的产品手册建立。

参考文献

Yasugi，M.，Kubota-Koketsu，R.，Yamashita，A.，Kawashita，N.，Du，A.，Sasaki，T.，Nishimura，M.，Misaki，R.，Kuhara，M.，Boonsathorn，N 。，Fujiyama，K.，Okuno，Y.，Nakaya，T.and Ikuta，K.（2013）。人类单克隆抗体广泛中和乙型流感病毒 PLoS Pathog < em> 9（2）：e1003150。