材料和试剂

细胞系：HCV复制子Huh-7人肝癌细胞系（含有新霉素抗性基因的HCV基因型1b亚基因组复制子pFKI389neo/NS3-3'/5.1，由R.Bartenschlager，Heidelberg University，德国提供）（Lohmann等 al。，1999; Krieger等人，2001）
0.1％胰蛋白酶-EDTA（WELGENE，目录号：LS015-01）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Hyclone ^TM，目录号：SH30919.03）
100x青霉素/链霉素溶液（Thermo Fisher Scientific，Hyclone ^TM，目录号：3V30010）
Lipofectamine 2000（Life Technology，目录号：11668-019）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S5886）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
Na 2 HPO 4（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
KH sub 2 PO 4（Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：S5881）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（参见配方）
完整的具有高葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Hyclone ^TM，目录号：SH30243.01）（参见Recipes）
50mg/ml G418（Merck KGaA，目录号：345810）（参见Recipes）
2％多聚甲醛溶液（Sigma-Aldrich，目录号：158127）（参见Recipes）
1％亚甲蓝（Duksan Scientific，目录号：MEE0-22002）（参见配方）

设备

程序

食谱

1x PBS
137 mM NaCl 2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
2mM KH 2 PO 4 sub/
将dH 2 O加至1L并使用高压灭菌器
灭菌
完全DMEM培养基（505ml）
50ml FBS
5ml 100x青霉素/链霉素溶液 450 ml DMEM
50mg/ml G418
1克G418粉末
将dH 2 O加至20ml，过滤（0.45μm）灭菌
等分
储存于-20°C
2％多聚甲醛溶液（15ml） 0.3g多聚甲醛
75μl10N NaOH
加至dH 2 0至13.5ml并在60℃下孵育直至多聚甲醛溶解
加入1.5ml的10x PBS并在4℃下保存
1％亚甲基蓝（15ml） 0.15g亚甲蓝
加至dH 2 2至15ml

致谢

该协议改编自Lee等人（2013）。资金来源包括韩国卫生保健技术研发项目由韩国卫生，福利和家庭事务部（A100399）和教育，科学技术部资助的韩国国家研究基金会（2012M3A9B6055200）的赠款。

参考文献

Krieger，N.，Lohmann，V。和Bartenschlager，R。（2001）。 E 通过细胞培养适应性突变增强丙型肝炎病毒RNA复制。 J Virol 75（10）：4614-4624。
Lee，C.H.，Lee，Y.J.，Kim，J.H.，Lim，J.H.，Kim，J.H.，Han，W.，Lee，S.H.，Noh，G.J.and Lee，通过针对HCV NS5B RNA复制酶的特异性RNA适体抑制丙型肝炎病毒（HCV）复制。 a> J Virol 87（12）：7064-7074。
Lohmann，V.，Korner，F.，Koch，J.，Herian，U.，Theilmann，L.and Bartenschlager，R。（1999）。在肝癌细胞系中复制亚基因组丙型肝炎病毒RNA。科学 285（5424）：110-113。