基于不同类型海洋微藻所含色素成分差异的流式分群分析
Marine Microalgae Pigment Analysis by Flow Cytometry   

材料与试剂

1. 70 μm细胞过滤器 (Beyogold, catalog number: FSTR040)
2. 流式管 (BD Falcon, catalog number: BD 352054)
3. 三角瓶
4. 原绿球藻 (Divinyl chlorophyll a、b)
5. 甲藻 (多甲藻黄素，Peridinin)
6. F/2-Si培养基 (Elite-Media, catalog number: M1197-02)
7. F/2微量元素溶液 (Elite-Media, catalog number: A345-01)
8. F/2维生素溶液 (Elite-Media, catalog number: A346-01)
9. PBS (pH = 7.2~7.4, Solarbio, catalog number: P1020)
10. NaNO₃
11. NaH₂PO₄·2H₂O
12. Na₂EDTA
13. FeCl₃·6H₂O
14. CuSO₄·5H₂O
15. ZnSO₄·7H₂O
16. CoCl₂·6H₂O
17. MnCl₂·4H₂O
18. Na₂MoO₄·2H₂O
19. 维生素B12
20. 盐酸硫胺素
21. 生物素
22. F/2-Si培养液 (见溶液配方)
23. 微量元素溶液 (见溶液配方)
24. 维生素溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 光照培养箱 (哈尔滨东联电子技术开发有限公司，model: HPG-280B)
2. 高压灭菌锅 (德国爱安姆高压灭菌器，model: L65)
3. 流式细胞仪 (美国BD公司，model: FACS AriaIII)
4. 低速离心机 (中科中佳科学仪器公司，model: LX-200)
5. 小型低温高速离心机 (德国Eppendorf公司，model: 5424R)
6. -80 °C冰箱 (中国海尔集团，model: DW-86L388)
   

实验步骤

1. 以原绿球藻 (Divinyl chlorophyll a、b) 和甲藻 (多甲藻黄素，Peridinin) 为实验样本。
2. 将2种藻类的藻种分别培养于含有100~150 ml F/2-Si培养基的250 ml的三角瓶中，放置在光照培养箱中。光照强度为50 μmol photon m^-2s^-1 (Hazeem等，2019)。
3. 待藻类生长到对数生长期 (增殖最快)，分别取2种藻液5 ml 进行后续实验。组1：2.5 ml 原绿球藻，组2：2.5 ml 甲藻，组3：2.5 ml 原绿球藻和2.5 ml 甲藻的混合液。将3组藻液300 x g室温离心5 min，弃上清。
4. 于藻类细胞沉淀中加入4 ml PBS，用移液枪吹打混匀，300 x g室温离心5 min，弃上清，预留200 μl液体，经70 μm滤膜过滤后流式细胞仪检测。
5. 在流式细胞仪上，选用488激光器，分别选用1 μm 不带荧光和FITC、PE标记的荧光微球 (用于荧光定量) 调节检测电压和荧光的阴性和阳性区域 (Barteneva等，2019)。上机检测至少获取1 × 10⁵ 的阳性细胞作后续数据分析。
6. 不同藻类所含特征色素不同，原绿球藻含有大量的叶绿素，因此呈现绿色 (488 nm，发射波长585 nm，检测通道FL2)；甲藻因多甲藻黄素的含量不同呈现出黄色、棕色甚至是红色 (激发波长488 nm，发射波长680 nm，检测通道FL3)。因此可通过其在流式细胞仪荧光区域的不同，实现对两种藻类植物快速、初步的分群研究 (Bustillos-Guzman等，2014；Dashkova等，2016)。
   

结果与分析

在绿色微藻-小球藻中存在多种荧光色素，如叶绿素、类胡萝卜素和虾青素等，主要呈现肉眼可见绿色和红色。Chen等研究发现，在兼养的条件下，小球藻中存在两种不同的荧光色素花青素和叶绿素，在FL1 (533 nm) 和FL2 (585 nm) 通道都呈现明显的荧光，且细胞大小也出现明显变化，呈现两种大小和色素含量不同的细胞群M1和M2 (图1A 和1C)。前向散射角FSC显示，M1细胞群的细胞尺寸较M2细胞群的细胞尺寸小，纵坐标显示M1细胞群所含花青素和叶绿素较M2细胞群的含量低。通过流式细胞仪可以对微藻所含色素进行快速的定性分析，此外通过标准荧光微球界定荧光的阴性和阳性区域可实现对微藻荧光的定量分析 (Chen等，2017)。


图1. 流式分析兼养型小球藻的荧光色素分布. 小球藻在兼养的条件下培养24 h，离心收集藻液，流式细胞仪检测其含有的色素成分。A.和C.横坐标为FSC，显示细胞的大小，纵坐标FL1为小球藻含有的虾青素自发荧光，FL2为小球藻含有的叶绿素自发荧光；B.和D.横坐标代表不同的荧光，纵坐标代表细胞数目 (Chen等，2017)。

溶液配方

1. F/2-Si培养液
   取天然海水经0.45 μm微孔滤膜过滤后定容到1 L，pH调至8.2，高压灭菌30 min待冷却后加入NaNO₃ (0.075 g)、NaH₂PO₄·2H₂O (0.00565g)、1 ml微量元素溶液和1 ml维生素溶液
2. 微量元素溶液
   1 L无菌水中依次加入Na₂EDTA (4.16 g)、FeCl₃·6H₂O (3.15 g)、CuSO₄·5H₂O (0.01 g)、ZnSO₄·7H₂O (0.022 g)、CoCl₂·6H₂O (0.01 g)、MnCl₂·4H₂O (0.18 g)、Na₂MoO₄·2H₂O (0.006 g)，每种成分完全溶解后再加入下一种成分过滤除菌，4 °C保存
3. 维生素溶液
   1 L无菌水中加入维生素B12 (0.0005 g)、盐酸硫胺素 (0.1g)、生物素 (0.0005 g)，过滤除菌，4 °C保存
   

致谢

本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金项目 (资助号：81703555，81773063，U1505225和81273548)、国家重点基础研究发展计划 (973计划) 项目 (资助号：2015CB931804)、中国大洋专项课题 (资助号：DY135-2-13)、福建省科技厅平台项目 (资助号：2018N2001)、教育厅平台项目和中国博士后科学基金 (资助号：2017M620268)的经费支持。

参考文献

1. Barteneva, N. S., Dashkova, V. and Vorobjev, I. A. (2019). Probing complexity of microalgae mixtures with novel spectral flow cytometry approach and “ virtual filtering”. BioRxiv.
2. Bustillos-Guzmán, J., Gárate-LizLrrága, I., López-Cortés, D. and Hernández-Sandoval, F. (2004). The use of pigment“fingerprims”in the study of harmful algal blooms. Rev Biol Trop 52 (Suppl.1)：17-26.
3. Chen, J., Wei, D. and Pohnert, G. (2017). Rapid estimation of astaxanthin and the carotenoid-to-chlorophyll ratio in the green microalga chromochloris zofingiensis using flow cytometry. Mar Drugs 15(7).
4. Dashkova, V., Segev, E., Malashenkov, D., Kolter, R.,Vorobjev, I. and Barteneva, N. S. (2016) Microalgal cytometric analysis in the presence of endogenous autofluorescent pigments. Algal Research 19: 370-380.
5. Hazeem, L. J., Kuku, G., Dewailly, E., Slomianny, C., Barras, A., Hamdi, A., Boukherroub, R., Culha, M. and Bououdina, M. (2019). Toxicity effect of silver nanoparticles on photosynthetic pigment content, growth, ros production and ultrastructural changes of microalgae Chlorella vulgaris. Nanomaterials (Basel) 9(7).