材料和试剂

小鼠胚胎干细胞（ESC）
M15细胞（ECACC：目录号：95102517）
小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）
0.1％明胶
PBS
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）高葡萄糖（Gibco ，目录号：11995-075）
DMEM低葡萄糖（Gibco ，目录号：11885-084）
胎牛血清（FBS）（Hyclone，目录号：SH30310.03）
200mM L-谷氨酰胺（L-Gln）（Nacalai Tesque，目录号：16948-04）
5,000单位/ml青霉素和链霉素（PS）的混合物（Nacalai Tesque，目录号：26252-94）
10mM MEM非必需氨基酸溶液（NEAA）（Gibco ，目录号：11140-050）
2-巯基乙醇（2-ME）（Sigma-Aldrich，目录号：M7522）
D - （+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G5146）
KnockOut血清替代品（KSR）（Gibco ^®，目录号：10828）
重组人LIF（Wako Pure Chemical Industries，目录号：129-05601）
重组人激活素A（R& D Systems，目录号：338-AC）
重组人bFGF（Pepro Tech，目录号：100-18B）
BIO（Calbiochem ^®，目录号：361550）
DAPT（Wako Pure Chemical Industries，目录号：041-30983）
丝裂霉素C（MMC）（Sigma-Aldrich，目录号：M4287）
0.05％胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，目录号：2014-11）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，目录号：25200-072）
EF介质（见配方）
维护介质（参见配方）
EB介质（参见配方）
内胚层培养基（见配方）
肠介质（见配方）

设备

6孔板（Corning，目录号：3516）
100mm皿（Corning，目录号：430167）
60mm培养皿（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353004）
离心机
37℃5％CO 2细胞培养箱

程序

M15细胞的制备
1. 将M15细胞（5×10 6个）接种到具有10ml EF培养基的100mm皿中。
2. 将M15细胞在37℃下在5％CO 2培养箱中温育
3. 当M15细胞汇合（2-3天）时，从100mm培养皿传代至5个100mm培养皿
  1. M15细胞用PBS洗涤
  2. M15细胞用1ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA在37℃下胰蛋白酶消化5分钟
  3. M15细胞在190×g下沉淀5分钟。
  4. 将M15细胞接种到5个100mm培养皿中。
4. 当M15细胞汇合时，将M15细胞与含有EF培养基的10μg/ml MMC在5％CO 2培养箱中在37℃下温育2小时。 M15细胞用MMC处理以阻止M15细胞增殖
5. MMC处理的M15细胞用PBS洗涤
6. MMC处理的M15细胞用1ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA在37℃下胰蛋白酶消化5分钟。
7. M15细胞在190×g下沉淀5分钟。
8. 在-150℃下将MMC处理的M15细胞重悬浮并冷冻在含有每管1×10 7个细胞的含有DMEM的22％FBS和20％DMSO的冷冻管中。
MEF的制备
1. 将MEF（5×10 6个）接种到具有10ml EF培养基的100mm培养皿中。
2. MEF在37℃下在5％CO 2培养箱中温育
3. 当MEF汇合（2-3天）时，从100mm培养皿通过到5个100mm培养皿
  1. MEF用PBS洗涤
  2. MEF用1ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA在37℃下胰蛋白酶消化5分钟
  3. MEF在190×g下沉淀5分钟。
  4. 将MEF细胞接种到5个100mm培养皿中。
4. 当MEF细胞汇合时，将MEF与含有EF培养基的10μg/ml MMC在5％CO 2培养箱中在37℃下温育2小时。 MEF用MMC处理以阻止M15细胞增殖
5. MMC处理的MEF用PBS洗涤
6. MMC处理的MEF用1ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA在37℃下胰蛋白酶消化5分钟。
7. M15细胞在190×g下沉淀5分钟。
8. 在-150℃下将MMC处理的M15细胞重悬浮并冷冻在含有每管2×10 6个细胞的含有DMEM的22％FBS和20％DMSO的冷冻管中。
维持小鼠ESC
1. 将2×10 6个MMC处理的MEF细胞接种到具有EF培养基的明胶预包被的60mm培养皿中。
2. 将MMC处理的MEF细胞在5％CO 2培养箱中在37℃温育过夜。
3. 将小鼠ESC（5×10 5）接种在具有维持培养基的MEF包被的皿上，并在37℃在5％CO 2培养箱中孵育（第0天）直到（3天）。
4. 每天更换培养基。
小鼠胚胎干细胞的肠分化
1. 将1×10 7个MMC处理的M15细胞接种到两个明胶包被的6孔板中，并在5％CO 2培养箱中在37℃温育过夜。 br />
2. 接种在MEF包被的培养皿上的ESC（步骤B3）用PBS洗涤
3. 将ESC用1ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA在37℃下胰蛋白酶消化5分钟
4. ESC细胞在190×g下沉淀5分钟。
5. 除去上清液，并将1×10 6个细胞/ml重悬于EB培养基中。
6. 将2ml EB培养基中的2×10 4个ESC接种到M15预包被的孔（第0天）。
7. 在第1天和第3天将培养基更换为内胚层培养基。
8. 培养基在第5天更换为肠介质。
9. 在第7,9,11,13,15,17和19天用2ml肠介质改变培养基（图1）。
  
  图1.在第12天（左）和在第20天（右）的PAS阳性粘液分泌功能杯状细胞的小鼠ESC-衍生的Cdx2（红色）表达肠内胚层。比例尺表示100μm。

食谱

EF介质
含有10％FBS的DMEM高葡萄糖 2 mM L-Gln
50单位/ml PS
维护介质
含有10％FBS的DMEM高葡萄糖 2 mM L-Gln
50单位/ml PS
100μMNEAA
100μM2-ME
LIF
EB中
含有10％FBS的DMEM高葡萄糖 2 mM L-Gln
50单位/ml PS
100μMNEAA
100μM2-ME
内胚层中层
EB培养基与10ng/ml激活素A
5 ng/ml bFGF
肠介质
2ml含有1mg/ml D - （+） - 葡萄糖的DMEM低葡萄糖 10％KSR
2 mM L-Gln
50单位/ml PS
100μMNEAA
100μM2-ME
5μMBIO
10μMDAPT

致谢

该协议改编自Ogaki等人（2013）。这项工作得到了Grant-in-Aid（＃21390280至S.K.和＃21790671至N.S.）的支持，部分由全球COE资助（Cell Fate Regulation Research and Education Unit， 5 ng/ml bFGF

肠介质
2ml含有1mg/ml D - （+） - 葡萄糖的DMEM低葡萄糖 10％KSR
2 mM L-Gln
50单位/ml PS
100μMNEAA
100μM2-ME
5μMBIO
10μMDAPT

致谢

该协议改编自Ogaki等人（2013）。这项工作得到了Grant-in-Aid（＃21390280至S.K.和＃21790671至N.S.）的支持，部分由全球COE资助（Cell Fate Regulation Research and Education Unit，...