材料和试剂

注意：所有化学品均购自Sigma-Aldrich（ http：//www.sigmaaldrich .com/united-states.html ），除非另有说明。

拟南芥幼苗或成熟组织
冰块
蔗糖（分子生物学，Sigma-Aldrich，目录号：84097）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H-3375）
EDTA（Research Products International，目录号：E57020）
PVP（40,000）（Fisher Scientific，目录号：BP431）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A-7906）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
亮肽素（Sigma-Aldrich，目录号：L2884）
PMSF（Sigma-Aldrich，目录号：P-7626）
苄脒（Sigma-Aldrich，目录号：B-6506）
胃酶抑素A（Sigma-Aldrich，目录号：P5318）
抑肽酶（Sigma-Aldrich，目录号：A1153）
BTP-MES（BIS-TRIS丙烷，Sigma-Aldrich，目录号：B6755; MES，Research Products International，目录号：M22040）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
葡聚糖（GE，目录号：17-0320-01）
聚乙二醇3350（Union Carbide Corporation，目录号：Carbowax 3350）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
研磨缓冲器（参见配方）
重悬缓冲液（见配方）
库存解决方案（参见配方）
相混合物（参见配方）
阶段系统（参见配方）

设备

Hermle Labnet Z383离心机（Labnet International）
Optima TM sup-L-90K超速离心机（Beckman Coulter）
TLX离心机（TLA 100.3转子）（Beckman Coulter）
Waring搅拌机瓶（Waring Pro型号：PBB212）
砂浆和杵
SW-28转子
尼龙SS-34管
SW-38管
3.5ml聚碳酸酯TLA 100.3管
2 ml螺丝帽管
10，15和50ml Falcon管
聚合物超速离心管（Beckman Coulter）

程序

膜制备
1. 打开Hermle Labnet Z383离心机。将温度设置为4°C。从5-d幼苗或成熟组织收集3-5g组织。挤压组织球干并称重。
  1. 对于大量样品（> 40g），将组织添加到Waring混合器罐和填充罐中，使得不存在空气。在冰桶里装冰。脉冲维持罐30秒，然后在冰中孵育 5分钟。重复3x。
  2. 对于少量样品（<10g），可以跳过该步骤，并且可以在研钵和杵中研磨缓冲液中研磨秧苗（参见步骤A2）。
2. 倒入预冷的蛾和杵在冰上。加入一点沙子（酸洗，Sigma 18649）。
  1. 立即用研钵和杵研磨约10分钟。
  2. 通过Miracloth衬里塑料功率漏斗设置到尼龙SS-34管。挤压通过Miracloth提取所有的液体匀浆。直立时从顶部填充管至1厘米。
  3. 如果产量差，或者样品仍然看起来"未研磨"，它可以返回到研钵和研杵，并再次在一小部分研磨缓冲液中研磨。
3. 平衡试管并在8,000×g，4℃离心15分钟。
  1. 打开Beckman Coulter Optima TM -L-90K超速离心机并将温度设置为4℃。
  2. 小心地从SS-34管上清除上清液，而不打扰沉淀。尝试不收集任何在上清液部分的深绿色沉淀物质（沉淀是非常容易打扰）。
  3. 收集细胞碎片沉淀，并储存在液氮中，直到使用，如果需要
4. 为了获得微粒体沉淀，将来自8000×g旋转的上清液在100,000×g，4℃下离心50分钟，1小时。将额外的上清液储存在冰上。
  1. 在SW-28转子中使用薄壁管。整个铲斗组件必须在0.005 g内平衡。确保将铲斗放置在正确的位置，并确认它们已正确接合转子。
  2. 倒出上清液并储存在-70°C（如果需要可溶性蛋白质）。
  3. 如果在冰上具有另外的上清液（来自8,000xg转速），从超速离心管倒出足够的上清液（来自100,000xg旋转），以允许用额外的8,000×g 上清液。平衡管，根据需要倒出100,000×g的上清液。重复50分钟旋转。
5. 倒出所有上清液 - 如上所述，如果需要。用Kimwipe或纸巾擦拭颗粒上方的管子内部。放在冰上。
6. 重悬在微粒体重悬浮缓冲液（体积将取决于丸大小和预期用途，通常1-2毫升）每个SW-28丸。使用截止1毫升移液器吸头重新悬浮起初。这将是困难的，因为微粒体是非常粘和疏水的。尝试不要让丸粒粘在移液管尖端或离心管的壁上。
  1. 在沉淀已经相当好地重悬（移液器上下100次）后，使用正常的1ml移液管尖端以"破碎"凝块，并更彻底地重悬微粒体（移液器上下移动100次）。
  2. 最后，使用200μl移液管尖端打碎块，并完全均匀的准备（移液器上下200次）。
  3. 如果需要洗涤沉淀，将重新悬浮的沉淀转移到3.5ml聚碳酸酯TLA 100.3管中。用一点额外的缓冲液洗涤每个SW-38管，并将其添加到TLA管。在TLX离心机（TLA 100.3转子）中在100,000×g离心30分钟，4℃。弃去上清液，擦干管壁，存放在冰上
7. 如步骤A6中那样将微粒体沉淀重悬在重悬浮缓冲液中。如果级分被储存，等分到500μl-1ml牵引在2ml螺旋盖管。在液氮中冷冻，并储存在液氮或-80°C冰箱直到使用
蔗糖密度梯度
注意：蔗糖溶液的制备：重要！蔗糖必须是超纯的。</em>
1. 在10ml试管中制备20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％（w/v）蔗糖溶液与20mM HEPES pH = 7.8,1mM EDTA。 > 注意：在旋转器上旋转管约20分钟，直到所有蔗糖溶解。
2. 在管（Beckman polyallomer超速离心管）的底部首先放入55％Suc的滴，然后将2ml的50％，45％，40％，35％，30％，25％和20％顶部，应该看到界面（见图1）。在移取0.5ml重悬的微粒体部分样品的管的顶部（来自膜制备）。
  注意：让蔗糖在管内非常缓慢地流下。蔗糖层在它们逐渐分层时应该是可见的。将具有蔗糖层的管在4℃下放置过夜以形成连续梯度。
  
  图1.显示蔗糖层界面的纸箱。应该清楚地看到不同浓度之间的所有界面。请仔细添加各浓度，以获得清晰的界面。
3. 离心机（Optima L-90K超速离心机）100,000×g 12小时。
4. 运行后立即从转子上取下管子，注意不要打扰蔗糖梯度层
5. 从上到下非常小心地将0.5ml级分收集到Eppendorf管中
质膜和内膜部分的两相分离
储备溶液，相混合物（2.7g）和相系统（30g）（参见配方）
1. 微粒体膜如上述A节所述制备
2. 将新鲜微粒体膜重悬于1ml缓冲液（0.33M蔗糖，3mM KCl和5mM磷酸钾，pH 7.8和20mg/ml来自Sigma-Aldrich的完全蛋白酶抑制剂混合物）中。
3. 将0.9g重悬浮的膜加入到2.7g两相分离混合物中（可以放大）。
4. 混合（倒置30次）后，通过在1,500×g离心（摇摆转子）5分钟分离各相。
5. 将上层细胞膜相小心地移至新管，并与等重量的新鲜下层溶液混合并重新分配（重复一次）。同样，下相（内体膜相）用等重量的上层相重新分配两次。
6. 最终的上和下相用10mM BTP-MES，pH7.8,1mM EGTA，1mM EDTA，0.29M蔗糖和20mg/ml完全蛋白酶抑制剂混合物分别稀释3倍和10倍，然后在120,000×g离心1小时。
7. 将沉淀重悬于10mM BTP-MES，pH7.8,1mM EGTA，1mM EDTA，0.29M蔗糖，20mg/ml完全蛋白酶抑制剂混合物中。

食谱

研磨缓冲器
研磨缓冲器	100 ml	300 ml
0.29 M蔗糖	10克	30克
25mM HEPES，pH = 8.5	0.6 g	1.8 g
20mM EDTA（二钠盐）	0.74克	2.23克
PVP（40,000）	0.5克	1克
0.2％BSA	0.2 g

pH至8.5
冷藏
使用前，请添加：

3 mM DTT（1 M股票）	300微升	900μl
200ng/ml亮肽素（200μg/ml母液）	100微升	300微升
PMSF（非AP测定）（100mM，在EtOH中）	100微升	300微升
200μM苄脒	100微升	100微升
（从200mM每种在EtOH中的储备液）
胃酶抑素A（2mg/ml STOCK）	100微升
抑肽酶（1mg/ml STOCK）	10微升	30微升

重悬缓冲液
重悬缓冲液	100 ml
10mM BTP-MES，pH7.8（1M储备液）	1 ml
250mM蔗糖	8.56克
20％甘油	20克

- 用于脂筏净化的膜的无GLYCEROL
使用前，请添加：

200ng/ml亮肽素（200μg/ml母液）	100微升
PMSF（不是AP测定）（在EtOH中为1,000mM）	100微升
200μM苯甲酰胺/苯甲脒（从200mM每种在EtOH中的储备液）	100微升
胃酶抑素A（2mg/ml STOCK）	100微升
抑肽酶（1mg/ml STOCK）	10微升

库存解决方案
20％（w/w）葡聚糖水溶液 40％（w/w）聚乙二醇3350的水溶液在4℃孵育2-3天
相混合物（2.7g） 1.116g 20％葡聚糖
0.558g 40％聚乙二醇3350
0.305克蔗糖 67.5μl0.2M磷酸钾（pH7.8）
4.1μl2 M KCl
加水至最终重量为2.7克
相系统（30g）
9.3g 20％葡聚糖 4.65g 40％聚乙二醇3350
3.389克蔗糖 0.75ml 0.2M磷酸钾（pH7.8） 45μl2 M KCl
加水至最终重量为30克
将相体系混合并使其在4℃下沉降过夜收集上相溶液和下相溶液（用于重新分配）在4°C单独存储

致谢

这项工作得到了能源部，基础能源科学部的资助。 DE-FG02-06ER15804至ASM。 HY作为由美国能源部，科学办公室，基础能源科学办公室，奖号DE-SC0000997资助的能源前沿研究中心的生物质直接催化转化生物质（C3Bio）中心的一部分提供支持。

参考文献

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