材料和试剂

3至4周龄的在温室中生长的烟草Nicosiana benthamiana 植物
根癌土壤杆菌菌株GV3101
对于共定位和FRET-FLIM测量，使用选择的pGWB（Gateway）二元载体（Nakagawa等人，2007）：
1. 编码Protein1（此处为HopQ1-mRFP）-mRFP的pGWB454
2. 编码Protein2（这里是14-3-3a-YFP）-YFP的pGWB441
3. pGWB444编码未融合，游离的CFP
4. pGWB441编码未融合，游离YFP
5. 编码与YFP融合的CFP的pGWB444
6. 编码蛋白1（此处为HopQ1-YFP）-YFP的pGWB441
7. 编码Protein1a-YFP（例如蛋白质1的突变变体）的pGWB441
8. 编码Protein2（这里是14-3-3a-CFP）-CFP的pGWB444

设备

对于显微镜评价
尼康立体显微镜SMZ 1500配备落射荧光设备（可选）
Nikon Eclipse TE2000-E倒置C1共聚焦激光扫描显微镜，配有PlanApo 63x浸油物镜，固态相干蓝宝石488nm激光器，氦氖（HeNe）543nm激光器，带三个光电倍增管的检测器单元
实用链接， http://www.microscopyu.com/
用于FRET-FLIM测量
FRET-FLIM实验程序对于装备有用于时间相关单光子计数（TCSPC）的FLIM模块SPC730（Becker和Hickl）的Zeiss LSM 510 META共焦激光扫描显微镜进行优化。单光子用光电倍增器MCP-PMT，R3809U-52，Hamamatsu Photonics检测。为了激发光子，使用超快振荡多光子激发激光器（钛 - 蓝宝石，Chameleon，Coherent）（Chameleon XS，Coherent）
显微镜载片（Gerhard Menzel GmbH，Menzel-Glaser ^{TM，目录号：AA00000112E）}
显微镜 1（Gerhard Menzel GmbH，Menzel-Glaser ^TM，目录号：BB024060A1）

软件

EZ C1适用于尼康C1共焦 - 图像采集
EZ C1查看器用于尼康C1共焦 - 图像分析
用于Zeiss Meta 510共聚焦的LSM 510 - 图像采集
Zeiss LSM图像浏览器 - 图像分析
用于FLIM测量的SPC操作软件（Becker& Hickl GmbH）
SPC-Image 2.9.1软件（Becker& Hickl GmbH， http：///www.becker-hickl.de/pdf/flim-zeiss-man37.pdf ） - 图像分析
ImageJ免费软件（ http://rsbweb.nih.gov/ij/） - 图像分析
MS Excel

程序

实验设计研究在活的植物细胞中共表达的融合蛋白的亚细胞定位
1. 选择荧光蛋白
  存在广泛范围的荧光蛋白变体，其用于构建可在活细胞中表达的荧光嵌合蛋白（ http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/fpintro.html）。不是所有的都已经在植物中测试。最近，一组荧光蛋白Gateway条目载体由Mylle等人于2013年产生，其为植物细胞生物学家提供了有价值的资源（ http://gateway.psb.ugent.be ）。绿色荧光蛋白（GFP）及其变色的遗传衍生物最常用于与感兴趣的蛋白质融合以监测其细胞定位。对于更复杂的成像实验，如多个融合蛋白的共定位研究，FP的选择必须基于将使用的共聚焦显微镜的技术规格。具有简单光学设置的仪器可以清楚地区分不具有或具有最小光谱重叠的荧光蛋白（例如CFP/GFP/RFP），应避免GFP和YFP的组合。使得光谱成像耦合到测量的光谱轮廓的数学线性解混合的共焦显微镜提供区分具有部分重叠光谱的大量不同荧光团的能力。
  在我们的用于分析亚细胞定位的实验室中，通常使编码感兴趣的蛋白的构建体与GFP或YFP融合，而红色（例如mRFP，mCherry）和绿色荧光蛋白通常组合用于共定位学习。荧光标记物的位置可以影响基因构建体的表达水平。因此，建议测试FP的N-末端或C-末端融合蛋白对其表达水平和定位模式的潜在后果。
  注意：如果感兴趣的蛋白质在N和C末端的FP的亚细胞定位模式是相似的，我们可以假设与FP的融合不影响蛋白质分选和蛋白质融合到达其在细胞中的目的地。然而，我们观察到一些蛋白融合与FP在N端可能完全保留在内质网，而FP在C端不影响其亚细胞靶向。相反的情况也是可能的。

显微评价
1. 建议比较单个光学切片，包括核和清晰可见的核仁。收集的图片可以使用图片分析免费软件ImageJ处理（ http://rsbweb.nih.gov/ij/）。 ImageJ是一个Java图像处理程序，可以由用户使用大量插件（在ImageJ网站上提供）进行补充，这些插件扩展了ImageJ的功能，可用于从共焦图像中提取定量数据。
ImageJ用于平均荧光强度测量
1. 我们应用ImageJ来测量在相互作用的配偶体存在下改变其分布的蛋白质的细胞区室中的平均荧光强度。有时，难以通过眼睛区分某些细胞区室中荧光强度是否已经改变;因此建议包括荧光图像的定量评价注意：对于荧光强度的定量评估和比较，绝对需要用相同的硬件参数拍摄图像，即物镜，激光功率，针孔开度，增益和偏移值，缩放因子，否则相对图像亮度的比较不是真的准确。为了最小化实验条件对植物样品中荧光强度的影响，建议准备和分析所有实验变体同时在相同条件下。
2. 所提出的实施例说明（图1）在相互作用配偶体，细菌效应物HopQ1-mRFP的存在下，14-3-3a-YFP定位于细胞核外并进入细胞质。观察到的现象可以表示为细胞核中的平均荧光强度与细胞质中的平均强度的比（N/C比）。因此，特定细胞区室中的平均荧光强度必须定量如下：
  
  图1.编码14-3-3a-YFP（A）的构建体的瞬时表达和14-3-3a-YFP和HopQ1-mRFP（B& C）在N中的共表达。本哈姆氏病叶。白色箭头表示细胞质，星号 - 细胞核，箭头 - 核仁。比例尺表示10μm。
  1. 对于荧光定量，选择具有缩放的核区域的共焦图像
  2. 将图像导出到ImageJ;打开插件列表并选择ROI /多测量使用绘图/选择工具在所选图像中绘制小的矩形或圆形感兴趣区域（ROI）。将每个ROI选择添加到多测量列表;我们通常在每个细胞区室（即细胞核和细胞质）中选择三个不同的ROI，并在背景中选择三个到四个。为了分析相同大小的ROI，可以通过将光标拖动到图像上的下一个位置来移动ROI选择，并将其添加到多测量列表（图2）。
  3. 从主菜单中选择分析/设置测量，并在复选框列表中选择面积，积分密度和平均灰度值。
    面积：方形像素的选择范围
    积分密度：区域和平均灰度值的乘积
    平均灰度值：选择中所有像素的灰度值之和除以像素数
  4. 在"多重测量"窗口中，按选择全部和测量，窗口结果将显示带有可导出到MS Excel（图2）的量化数据。
    
    图2. ImageJ
    的多个ROI的荧光强度测量
  5. 所有选定的ROI可以通过单击多个测量窗口中的绘制按钮在图像上绘制。
  6. 在计算每个ROI的荧光分布比（图3）之前，必须进行荧光强度的背景校正，如下所示：
  7. ROI1 =综合密度ROI1 - （面积ROI1 *平均背景平均灰度值）
  8. 背景校正的N/C比率是从细胞核和细胞质中的平均荧光强度计算的。对于N/C比率计算，应分析来自每个实验组合的25个细胞。根据成像条件，绝对N/C值可能在实验之间有些变化，因此应当对配对实验进行比较。
    
    图3.细胞核和细胞质内的荧光强度的背景校正和单独或在HopQ1存在下表达的14-3-3蛋白的N/C比的计算
FRET-FLIM用于分析与YFP和CFP融合的蛋白质之间的相互作用，在本氏烟草的叶表皮细胞中共表达
1. FRET-FLIM实验设计
  1. 对于FRET-FLIM实验，每个潜在相互作用的蛋白必须融合到合适的荧光团，显示一起构成"FRET对"的光谱性质。在这里我们描述一个常用的FRET荧光对之一的协议：青色荧光蛋白（CFP，捐助者）和黄色荧光蛋白（YFP，受体）。存在可用于FRET-FLIM测量的FP标记蛋白的其他组合，例如作为供体的eGFP（增强型绿色荧光蛋白）和作为受体的mCherry（单体樱桃红色荧光变体）（更多 http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html ）。可用的显微镜设置通常决定将使用的荧光团对。
  2. FRET是一种从供体到受体荧光团的无辐射能量转移的过程，如果它们在附近（距离<10nm）。在FRET-FLIM成像中，仅测量供体荧光团寿命，这里是CFP。该参数是指荧光团的激发态的持续时间，并且可以受外部因素如pH或在受体的存在情况下的影响。当FRET发生时，可以测量施主的荧光寿命的缩短
  3. 需要瞬时表达以下融合蛋白组合的植物细胞：
    1. 未熔化，单独的CFP（用于初始成像校准）
    2. 共表达的未融合的游离CFP和未融合的游离YFP（阴性对照1号）
    3. CFP与YFP（阳性对照，由11个氨基酸分开）融合
    4. 仅蛋白2-CFP
    5. 蛋白2-CFP和未融合的游离YFP（阴性对照2号）
    6. 蛋白2-CFP和蛋白1-YFP和任选地
    7. 蛋白2-CFP和蛋白1a-YFP的突变变体
2. 基因构建体在植物细胞中的瞬时共表达
  1. 渗透。本bent与 tumefaciens （GV3101），如Xiyan Li（Li，2011）所述。
    注意：
    1. 对于浸润，用平叶片选择较老的叶子（但避免子叶），较年轻的叶子更加折叠，使得它们不方便用于显微镜，因为在显微镜载玻片上拉伸是不可能的。
    2. 在注射过程中避免用叶子组织损伤; 死细胞的强自发荧光可能是混乱的; 你可以让小4-5受伤（背部）表皮，在刀刃周围用移液管尖端（尺寸高达200μl），并且通过在损伤部位按压注射器渗透整个叶，这显着改善了叶组织的渗透。
  2. 在浸润之前，将携带有与CFP和YFP融合的编码蛋白质的质粒的土壤杆菌培养物以等量混合到最终的OD 600 0.6-1.0。
  3. 三天后，在荧光立体显微镜下检查叶片，以检查表达CFP和YFP融合蛋白的植物细胞在可接受的水平。如果表达水平非常低，在FLIM测量期间检测到的光子的数量可能不足以用于寿命计算。
3. FLIM测量
  1. N。本生烟草叶碎片置于载玻片上的一滴水中，并盖上盖玻片
  2. 对如"FRET-FLIM实验设计"部分所述制备的植物样品进行测量，并且共聚焦显微镜设置如先前由Kwaaitaal等人所述（2010）。
  3. 对于植物细胞共表达的CFP和YFP融合蛋白的共聚焦成像，使用40x平面复消色差水浸物镜。 CFP和YFP分别用来自Agron激光器的458nm和514nm激光线激发。 FLIM的CFP激发需要调谐到840nm波长的超快多光子激发钛：蓝宝石激光用于CFP的双光子激发，调节到15-20％的透射率。较高的激光透射可以产生局部加热，导致细胞损伤，导致自发荧光和人工光子发射
  4. 所选的感兴趣区域连续扫描120秒，分辨率为128×128像素和256个时间通道。通常这足以获得荧光衰减的直方图，表示在扫描的ROI的每个像素中在每个检测时间记录的光子的数量。
  5. 使用SPC-Image 2.9.1软件分析直方图。原始数据显示为强度图像（图4，b + w图像，左），从中计算生命期图像（彩色编码图像右图），显示扫描的ROI的寿命分布。在图像（图4）中，可以选择子ROI以显示相应的寿命分布。为了计算荧光寿命，将各个像素中的衰减曲线拟合到适当的模型。对于估计，必须选择强度图像上的最亮区域。典型模型是单指数或多重电位衰减曲线。我们假设供体单独显示单指数衰减，而双指数模型充分描述了FRET情况。用于将数据拟合到模型的度量， 1.2被认为是适合的。
    
    图4. SPCImage分析软件的主面板，显示来自FLIM测量的数据，收集阳性对照CFP-YFP蛋白融合
  6. 作为仪器响应函数（IRF），其定义为FLIM系统的脉冲形状记录无限短荧光寿命，采用通过SPCImage数据分析软件计算的值，在我们的实验中其足以获得相关的寿命数据。
  7. 可以通过使用合并因子和阈值水平来排除具有低光子数的像素来改善荧光衰减函数的拟合（更多http://www.becker-hickl.de/pdf/flim-zeiss-man37.pdf ）。对于单个单元格的平均寿命的计算，数据导出到Ms-Excel程序

致谢

该协议基于Giska等人（2013）描述的程序。

参考文献

Becker W.（2010）。 bh TCSPC手册。第四版。 Becker和Hickl GmbH。

Giska，F.，Lichocka，M.，Piechocki，M.，Dadlez，M.，Schmelzer，E.，Hennig，J.and Krzymowska，M。（2013）。 HopQ1的磷酸化，一种来自丁香假单胞菌的III型效应物，创造了一种用于宿主14-3-3蛋白的结合位点。植物生理学 161（4）：2049-2061。

Kwaaitaal，M.，Keinath，N.F.，Pajonk，S.，Biskup，C.and Panstruga，R。（2010）。组合的双分子荧光互补和Forster共振能量转移显示活植物细胞中的三元SNARE复合物形成。 a> Plant Physiol 152（3）：1135-1147。

Lichocka，M。（2014）。用于共表达与菜豆绿叶片表皮细胞中的YFP和mRFP融合的蛋白质的生物轰击em>'red mexican'。生物协议 4（1）：e1019。

李X（2011）。通过土壤杆菌介导瞬时表达。生物协议 1（14）：e95

Mylle，E.，Codreanu，M.C.，Boruc，J.and Russinova，E。（2013）。荧光蛋白在活植物细胞中的发射光谱分析植物方法 9（1）：10.

Nakagawa，T.，Suzuki，T.，Murata，S.，Nakamura，S.，Hino，T.，Maeo，K.，Tabata，R.，Kawai，T.，Tanaka，K.，Niwa， Watanabe，Y.，Nakamura，K.，Kimura，T。和Ishiguro，S。（2007）。改进的Gateway二元载体：用于在植物的转基因分析中创建融合构建体的高性能载体。/a> Biosci Biotechnol Biochem 71（8）：2095-2100