材料和试剂

CD4 + T细胞系H9细胞（ATCC HTB-176）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：SH30071.03 HI）
注意：这个特定的FBS已经由作者测试，但可以由用户期望的来自不同供应商的FBS替代。
青霉素 - 链霉素液体（Life Technologies，Gibco ，目录号：15070-063）
细胞培养基：RPMI1640（Life Technologies，Gibco ，目录号：11875-093）（参见配方）

设备

台式离心机
CO <2>孵化器
-80°C冰箱
50ml锥形管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：35-2070）
（BD Biosciences，Falcon ，目录号：35-7501,35-7554,35-7556），在37℃，5分钟，10分钟，
T-75，T-175细胞培养瓶（BD Biosciences，Falcon ，目录号：35-3136,35-3112）
CryoTube小瓶（NUNC，377267）

程序

第1天

在50ml的falcon管中，在2ml培养基（终浓度1×10 6个细胞/ml）中稀释2×10 6个未感染的H9细胞。
向Falcon管中加入1ml HIV-1病毒（IIIB菌株）。
每15分钟轻轻摇动1小时。
将这种最低限度的培养物吸入50 ml培养基中的T-75细胞培养瓶中
在37℃孵育4天第5天
向2个新的大型隼T-175细胞培养瓶中的每一个中加入175ml新鲜培养基
向每个烧瓶中加入25ml的4天培养物。
在37℃孵育3天第8天
使用25-ml移液管（每管40ml）将HIV-1感染的细胞（400ml）转移到10×50-ml falcon管中。
在二级容器中以1300rpm离心8分钟。
使用真空管小心地移除上清液，用移液管吸头连接到10ml移液管（填充收集瓶用漂白剂）。
向每个管中加入2ml新鲜培养基并松开细胞沉淀。
收集所有细胞在2管中，用新鲜的培养基冲洗其他8管，并添加到那些2管。
向这两个管中的每一个中加入新鲜培养基至终体积为40ml。
在二级容器中以1300rpm离心8分钟。
除去上清液。
向每个烧瓶中加入10ml新鲜培养基，并松开细胞沉淀
组合成一个管。
使用管架击打细胞20秒。
在二级容器中以2,000rpm离心8分钟。
使用移液管转移上清液到新鲜的50毫升falcon管（上清液1）。
加入10毫升新鲜培养基与细胞沉淀管和松动细胞沉淀。
使用管架再次击打细胞。
在二级容器中以2,000rpm离心8分钟。
使用移液管转移上清液到新鲜的50ml的falcon管（上清液2）。
使用5ml移液管（每管1ml）（具有IIIB的标签管，日期和Sup1或Sup2）将Tranfer上清液1和2倒入小CryoTube小瓶中。
储存于-80°C冰箱

笔记

使用HIV-1的实验需要在BSL-3实验室进行，人员需要接受针对HIV-1病毒的特殊培训。

食谱

培养基（500ml）

RPMI1640介质
500 ml

FBS
50 ml

青霉素 - 链霉素
5 ml

致谢

作者感谢Dutschman，GE和Yung-Chi Cheng在耶鲁医学院药理学系的适应这种方法和他们对抗HIV-1药物开发研究的支持。

参考文献

Dutschman，G.E.，Grill，S.P.，Gullen，E.A.，Haraguchi，K.，Takeda，S.，Tanaka，H.，Baba，M.and Cheng，Y.C。（2004）。小说4'-取代的司他夫定类似物具有改善的抗人类免疫缺陷病毒活性和降低的细胞毒性。 Antimicrob Agents Chemother 48（5）：1640-1646。