材料和试剂

蔗糖（Duchefa Biochemie BV，目录号：S0809）
Daishin琼脂（Duchefa Biochemie BV，目录号：D1004）
6-苄基氨基嘌呤（BAP）（Duchefa Biochemie BV，目录号：B0904）吲哚-3-丁酸（IBA）（Duchefa Biochemie BV，目录号：I0902）
Murashige和Skoog盐，包括维生素（MS）（Duchefa Biochemie BV，目录号：M0221）
Gelrite（Duchefa Biochemie BV，目录号：G1101）
3'，5'-二甲氧基-4'-羟基 - 苯乙酮（Acetosyringone）（Sigma-Aldrich，目录号：D134406）
LB肉汤（LB）（Sigma-Aldrich，目录号：L3022）
利福平（Duchefa Biochemie BV，目录号：R0146）
二甲基亚砜（DMSO）（Merck KGaA，目录号：802912）
MN615滤纸82mm（MACHEREY-NAGEL GmbH& Co.KG，目录号：MN615）
噻苯隆（TDZ）（Duchefa Biochemie BV，目录号：T0916）
1-萘乙酸（NAA）（Duchefa Biochemie BV，目录号：N0903）
头孢噻肟钠盐（头孢噻肟）（Duchefa Biochemie BV，目录号：C0111）
卡那霉素一硫酸盐一水合物（卡那霉素）（Duchefa Biochemie BV，目录号：K0126）
D-葡萄糖一水合物（葡萄糖）（Duchefa Biochemie BV，目录号：G0802）
拍摄倍增介质（SMM）（参见配方）
拍摄传播介质（SPM）（参见配方）
射击再生介质（SRM）（葡萄糖）（见配方）
SRM + AS（请参阅配方）
SRM SEL（参见配方）
MS-liquid + AS（参见配方）
1 mg/ml NAA（参见配方）
0.22 mg/ml TDZ（参见配方）
1 mg/ml IBA（见配方）
1mg/ml BAP（参见配方）
100 mM AS（参见配方）
125 mM头孢噻肟（见配方）
50mg/ml卡那霉素（见Recipes）
50 mg/ml利福平（见配方）
30克/100毫升葡萄糖（见配方）

设备

50ml管（Greiner Bio-One GmbH，目录号：210261）
培养皿（Greiner Bio-One GmbH，目录号：633180）
旋转振荡器（C24培养摇床，New Brunswick Scientific）
离心机Multifuge 3LR（Heraeus Holding）

程序

对于草莓的转化，我们利用'in vitro '生长的植物。将这些植物在无菌条件下在作为Murashige和Skoog macro和微量元素和维生素（Murashige和Skoog等人，1962）（MS）（2.2g/L）的枝条繁殖培养基（SPM），添加浓度为0.1mg/L（pH5.8）的BAP和IBA和作为MS（2.2g/L）的枝条繁殖培养基（SMM）的蔗糖（30g/L）Daishin琼脂（9g/，添加了浓度为0.5mg/L（pH 5.8）的BAP的蔗糖（30g/L）Daishin琼脂（9g/L）。
通过将侧枝转移至新鲜的SPM，将植物每4-6周传代培养，并在25℃的培养室中在光照（16小时/8小时光/暗）中生长。
在无菌条件下在生物安全下流橱中进行转化。对于转化，从在SPM上生长四周的"体外"叶材料切下直径为7mm的叶圆片。将叶圆片收集在含有共培养培养基的腐皮中，其为SRM + AS [SRM; （100μM）的葡萄糖（30g/L），NAA（0.2mg/L），TDZ（1.0mg/L）和gelrite（4g/L）（pH5.8）的MS（2.2mg/]。
包含超强毒力Ti质粒pTIBo542（Lazo等人，1991）的土壤杆菌属菌株AGL0以及含有卡那霉素抗性基因的二元载体（ptII）作为植物选择性标记）在含有10ml补充有卡那霉素（50mg/L）和利福平（50mg/L）的液体LB培养基的50ml管中培养过夜。将细菌在28℃的旋转振荡器中孵育
过夜生长后，通过在2,000xg（3,000rpm）离心10分钟使细菌沉淀，将细菌沉淀重悬于40ml含有葡萄糖（30g/l）的过滤灭菌的液体MS-培养基中， L）和乙酰丁香酮（100μM）（pH 5.2）
为了转染，将20ml重悬浮的土壤杆菌倒在叶盘上，在切片并收集之前，在含有共培养培养基的培养皿中。
在10-20分钟后，将叶圆片在一张滤纸上吸干，随后放置在由MN615滤纸圆盘覆盖的新鲜共培养基上。将叶盘放置成使其正轴侧与滤纸接触（因此，上下颠倒），并在无菌条件下与农杆菌细胞共培养4天，在黑暗中21℃。
在共培养后，将叶圆片转移到补充有头孢噻肟（250mg/L）的SRM中，用于消除土壤杆菌和卡那霉素（100-150mg/L）以选择性再生枝条。在经历具有农杆菌的叶盘过度生长的情况下，可以在转移到SRM之前在含有500mg/L头孢噻肟的溶液中洗涤叶盘。将叶圆片在21℃和16小时/8小时光/暗条件下的生长室中培养
每4周更新SRM培养基，收获在叶圆片上再生的芽，并转移到含有具有卡那霉素（50mg/L）和头孢噻肟（250mg/L）的枝条繁殖培养基（SPM）的罐中用于进一步选择和繁殖在无菌条件下，在24℃和16h/8h光/暗条件下。在典型的转化实验中，50-100％的叶盘产生转基因苗
在该培养基上繁殖良好并产生根的枝条转移到相同的培养基中，但现在没有卡那霉素和头孢噻肟，显示不存在土壤杆菌，并且在形成足够的根之后，将植物转移到温室中进一步评价

食谱

注意：所有含抗生素或IBA（对光敏感）的培养基应该新鲜制备。所有其他媒体最多可存储14天。

草莓传播的媒介
1. 拍摄倍增介质（SMM）
  为1000ml
  
  MS
  4.4克
  
  蔗糖
  30克
  
  Agar Daishin
  9克
  
  BAP
  0.5ml BAP-储备液（1mg/ml），终浓度0.5mg/L
  
  pH = 5.8
  高压灭菌（激素是自动灭菌）
2. 拍摄传播介质（SPM）
  为1000ml
  
  MS
  4.4克
  
  蔗糖
  30克
  
  Agar Daishin
  9克
  
  BAP 0.1ml BAP-原液（1mg/ml），终浓度0.1mg/L） IBA 0.1ml IBA-原液（1mg/ml），终浓度0.1mg/L） pH = 5.8
  高压灭菌（激素被高压灭菌）
  植物在交替循环中在SMM上培养4-6周，然后在SPM上培养4-6周。为了转化，使用在SPM培养基上生长4周的植物叶。

草莓转化的媒体

芽再生培养基（SRM）（1,000ml）

溶解：	4.4 g MS
	4 g gelrite
	加入到900ml MilliQ水中
添加：	0.2ml NAA-原液（1mg/ml）（最终浓度= 0.2mg/L）
	4.5ml TDZ-原液（0.22mg/ml）（最终浓度= 1mg/L）
	用0.1N KOH将pH调节至5.8
	在高压灭菌后加入100ml过滤灭菌的葡萄糖原液（30g/100ml）

对于SRM + AS（1,000 ml）
添加到SRM（高压灭菌后）
1000μl乙酰丁香酮原液（100mM）（终浓度100μM）
对于SRM SEL（1,000 ml）
添加到SRM（高压灭菌后）
1000μl卡那霉素原液（50mg/ml）（终浓度100mg/L） 2,000μl头孢噻肟 - 原液（125mg/ml）（终浓度250mg/L）

MS-液体+ AS（1,000ml）

溶解：	4.4克MS-盐+维生素
	30克葡萄糖
	加入到1,000ml MilliQ中
添加：	1,000μlAS-原液（100mM）
	用0.1N KOH将pH调节至5.2（！）
	过滤灭菌并在4℃下储存在50ml管中

库存解决方案
1. NAA（1mg/ml）将50mg NAA溶解在1ml 0.1N KOH中，并用MilliQ调节体积至50ml; 储存在4℃下
2. TDZ（0.22mg/ml）将55mg TDZ溶于1ml 0.1N KOH中并用MilliQ调节体积至250ml; 储存在4℃下
3. IBA（1mg/ml）将50mg IBA溶解在1ml 0.1N KOH中并用MilliQ调节体积至50ml; 储存在4℃下
4. BAP（1mg/ml）将50mg BAP溶解在1ml 0.1N KOH中并用MilliQ调节体积至50ml; 储存在4℃下
5. AS（100mM）
  将98mg乙酰丁香酮溶于300μlDMSO中，用乙醇绝对调节体积至5ml; 储存在4℃下
6. 头孢噻肟（125mg/ml）
  溶解1000毫克头孢噻肟的8毫升MilliQ; 过滤灭菌; 储存在4℃下
7. 卡那霉素（50mg/ml）
  将400mg卡那霉素溶解在8ml MilliQ中; 过滤灭菌; 储存在4℃下
8. 利福平（50mg/ml）
  将400mg利福平溶于100μl0.1N HCl中，用MilliQ调节体积至8ml; 过滤灭菌储存于-20°C
9. 葡萄糖（30g/100ml）
  将300g葡萄糖溶解在1,000ml MilliQ中; 过滤灭菌; 在室温下储存在50ml管中

致谢

该方案改编自Passey等人（2003）描述的芽再生方法和超强毒农杆菌菌株AGL0（Lazo等人，1991）的使用，。

参考文献

Husaini，A.M.，Mercado J.A.，Teixeira da Silva J.A.，Schaart J.G. （2011）。评价影响器官发生，体细胞胚发生和根癌土壤杆菌介导的草莓转化的因素。 In：Husaini AM，Mercado JA（Eds），Genomics，Transgenics，Molecular Breeding and Biotechnology of Strawberry。 Genes，Genomes and Genomics 5（Special Issue 1），Global Science Books Ltd.，Isleworth，United Kingdom：1-11
James，D.J.，Passey，A.J.，Barbara，D.J。（1990）。农杆菌 - 介导的栽培草莓转化（ Fragaria x ananassa Duch。）使用撤防的二元载体。植物科学 69，79-94。
Lazo，G.R.，Stein，P.A.and Ludwig，R.A。（1991）。土壤杆菌属中的DNA转化能力的拟南芥基因组文库 /em>。 Biotechnology（NY） 9（10）：963-967
Murashige，T。和Skoog，F。（1962）。用烟草组织培养快速生长和生物测定的修订培养基。 Physiologia Plantarum 15（3）：473-497。
Nehra，N.S.，Chibbar，R.N.，Kartha，K.K.，Datla，R.S.，Crosby，W.L.and Stushnoff，C。（1990）。使用叶盘再生系统通过根癌土壤杆菌进行的草莓的遗传转化。 em> Plant Cell Rep 9（6）：293-298。
Passey，A.J.，Barrett，K.J.and James，D.J。（2003）。来自七个商业草莓栽培品种（ Fragaria x ananassa Duch）的不定芽再生。）使用一系列外植体类型。植物细胞报道 21（5）：397-401。
Schaart，J.G.，Kjellsen，T.D.，Heggem，R.，Iversen，T.H，Schouten，H.J.and Krens，F.A。（2011）。生产转基因的草莓是消费者可以接受的。 In：Husaini AM，Mercado JA（Eds）Genomics，Transgenics，Molecular Breeding and Biotechnology of Strawberry.Ing Genes，Genomes and Genomics 5（Special Issue 1），Global Science Books Ltd.，Isleworth，：102-107。
Shulaev，V.，Sargent，D.J.，Crowhurst，R.N.，et al。（2011）。林地草莓的基因组（ Fragaria vesca ）。 Nat Genet 43（2）：109-116。