材料和试剂

B。枯草芽孢杆菌
三氯乙酸（Merck KGaA，目录号：1.00.807.0250）
丙酮（J.T.Baker ，目录号：9006-01）
BCA测定（Pierce Antibodies，目录号：23225）
酪蛋白水解物（Oxoid Limited，目录号：LP0041）
（CH） - 介质（参见配方）
解决方案G（参见配方）
重悬缓冲液（参见配方）

设备

50ml带有挡板的烧瓶
Acrodisc 注射器过滤器，孔径为0.2μm（Pall，目录号：4652）
冷冻离心机（例如：Eppendorf，型号：5810R）

程序

接种 B。（LB），Spizizen基本培养基（SMM）中，在适当的培养基[例如CH]中培养至OD 600为0.1。这里我们在CH-培养基中使用10ml培养物]
将细胞生长至相应的OD 600（这里我们使用4的OD 600;在37℃下生长的细胞;在具有挡板的50ml烧瓶中150rpm）。< br/>
通过离心收集细胞（≥2,800×g; 4℃; 20分钟）。
注意：保持细胞沉淀作为后续SDS-PAGE分析的对照。
将上清液转移到新管中并再次离心（2,800×g; 4℃; 20分钟）。
重复步骤4.
收集上清液并使用孔径为0.2μm的Acrodisc 注射器过滤器对其进行无菌过滤。
向溶液中加入冰冷的三氯乙酸[90％（w/v）储备液]至终浓度为10％（v/v）。这将导致蛋白质在溶液中沉淀
通过离心（11,000×g; 4℃，5分钟）收获沉淀物。一个小的白色颗粒应该是可见的。
用2ml冰冷的丙酮（PA级或更高质量）和离心（11,000×g; 4℃，5分钟）洗涤沉淀两次。
1. 对于定量分析，在60℃下干燥沉淀物15分钟以除去残余痕量的丙酮。此外，沉淀应该重悬浮在H 2 O中而不是缓冲液中（步骤10）。
在重悬缓冲液中重悬沉淀（我们使用50μl的体积）注意：体积可以相对于您的细胞量（分泌的蛋白质）按比例放大或缩小。
分泌的蛋白质的量可以通过BCA测定法分析或通过SDS-PAGE分析。
注意：作为对照，如果分离成功，分离的分泌蛋白和沉淀的细胞（见步骤3）应重新悬浮在H 2 O或缓冲液（5-10倍体积的沉淀细胞）并通过SDS-PAGE分析。分离的蛋白质和细胞的条带模式应当不同。如果条带模式是相似的，你的孤立的蛋白质可能被细胞污染。

食谱

CH-medium
50ml溶液G（见下文）
0.05ml 0.1M CaCl 2·h/v 0.02ml 1M MgSO 4。7H 2 O 2 0.1ml 0.0475M MnSO 4
0.5ml 2mg/ml色氨酸
注射器过滤器过滤灭菌;使用Acrodisc 新鲜准备
解决方案G
25.0g酪蛋白水解产物 9.2g L-谷氨酸 3.125g L-丙氨酸 3.48g L-天冬酰胺 3.4g KH 2 PO 4 sub/
1.34g NH 4 Cl
0.27g Na 2 SO 4。
0.24g NH 4 NO 3 sub。 2.45mg FeCl 3 。 6H 2 O ddH 2 O 2.35L，并用10N NaOH调节pH至7.0 高压灭菌; 储存在4℃下
重悬缓冲液
5mM MgCl 2/
50mM Tris-HCl（pH7.4）

致谢

该协议改编自Bach和Bramkamp（2013）。

参考文献

Bach，J.N.和Bramkamp，M。（2013）。 Flotillins功能性组织细菌膜。 Mol Microbiol 88 （6）：1205-1217。