材料和试剂

Raji细胞（ATCC）
A/California/04/2009（H1N1）流感病毒（参考实验室）
土耳其红细胞（来自动物）
含有10％热灭活胎牛血清（FCS）和2％L-谷氨酰胺的血清（完全培养基）RPMI 1640（Life Technologies）的组织培养基。
血清，白蛋白或其他系统相容性蛋白（FBS）（Life Technologies，目录号：10099141）
PKH67细胞标记染料（Sigma-Aldrich，目录号：MIDI67）
7-AAD Stain（Life Technologies，目录号：A1310）
PBS（不含钙镁）（Life Technologies，目录号：10010-023）
RPMI 1640培养基（Life Technologies，目录号：12633-020）
Pen/Strep（Life Technologies，目录号：10378016）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）

设备

圆底96孔板
温度控制离心机
聚丙烯锥形底部离心管（4-15 ml）
生物安全柜
血细胞计数器或细胞计数器
幻灯片和盖玻片
用于荧光分析的仪器（流式细胞仪）
37℃，5％CO 2培养箱

程序

靶细胞的预处理
1. 在用A/California/04/2009（H1N1）流感病毒在BSL-3设备中测定之前，在MOI 2,4,8小时感染Raji细胞，以多重性给予约80-95％的感染细胞。注释4中的详细过程。
2. 感染后48小时取目标细胞样本，以评估感染细胞的发生率，通过其与土耳其红细胞产生hem凝集和与多克隆抗体结合的能力。注释5中的详细过程。
3. 2×10 6个细胞用PBS洗涤两次
4. PKH67细胞标记根据Sigma-Aldrich的通用细胞膜标记方案进行。
效应细胞的制备（PBMC的分离）
1. 根据Panda和Ravindran（2013）给出的方法，从健康志愿者的血液样品中分离PBMC。
2. 用PBS洗涤两次分离的PBMC。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性测定（ADCC）
使用基于活细胞和死细胞鉴别原理的基于流式细胞术的方法测定抗体依赖性细胞毒性（Srivastava等人，2013）。

按照在圆底96孔板中给出的布局一式两份，在每个孔中在50μlRPMI 1640培养基中分配5.0×10 4个标记的靶细胞。
按照布局向孔中加入50μl抗体（来自感染患者的血浆的总IgG，1μg/ml和/或5μg/ml，得到0.5μg/ml和2.5μg/ml）。
在37℃下在CO 2培养箱中孵育15分钟
按照布局将未标记的正常PBMC效应细胞以2.5×10 7个细胞/ml的浓度加入到100μl的RPMI 1640/0.5％Pen/Strep中。
在37℃下在CO 2培养箱中孵育细胞2小时
2小时后加入1μl荧光死细胞染料7-氨基 - 放线菌素D（7-AAD）。
在4℃避光孵育20分钟。
在FACS机上分析细胞。总共有5,000个靶细胞获得

通过软件分析四个可识别的细胞群，活效应细胞（无染料），死效应细胞（仅7-AAD），活靶细胞（仅PKH-67）和死靶细胞（PKH-67和7 -AAD）。

1	2	3	4	5	6	7
未染色的目标单元格	未染色效应细胞	PKH67染色靶细胞	7AAD染色靶细胞	PKH67染色靶细胞+培养基+ 7AAD染色	PKH67染色的靶细胞+5μl1％Triton X-100 + 7AAD染色	PKH67染色的靶细胞+抗体+ 7AAD染色

FACS分析步骤
1. 识别总（活和死）靶细胞区（FSC vs SSC）（5,000）（孔1）
2. 识别效应细胞区（FSC vs SSC）（5,000）（2号孔）
3. 获得PKH67阳性细胞（5,000）（孔3）
4. 获得7AAD阳性细胞（5,000）（孔4）
5. 获得所有孔5,6和7（5,000个PKH67阳性细胞）
6. 通过门控PKH67细胞，然后选通7AAD阳性细胞定位双阳性群体（PKH67和7AAD）。

笔记

测定对照将用于定义包含无抗体的靶细胞（背景细胞死亡）的细胞群和具有5μl1％Triton X-100（最大荧光）的靶细胞。
数据表示为ADCC％增加％（IgG存在时的细胞死亡％ - IgG不存在时的细胞死亡％）/（最大裂解中的细胞死亡％ - 不存在IgG时的细胞死亡％）x100。
应使用来自三个健康志愿者的汇集的PBMC对每个IgG重复实验
感染Raji细胞（简要）
1. 10ml 2×10 5个细胞/ml，用5ml含有2μg/ml TPCK-胰蛋白酶的RPMI1640洗涤3次。
2. 除去培养基并在MOI2接种A/California/04/2009（H1N1）流感病毒。
3. 允许接种物在37℃吸附60分钟。
4. 用6ml含有2μg/ml无血清的TPCK胰蛋白酶的培养基（RPMI1640）轻轻洗涤。
5. 将含有2μg/ml含2％小牛血清的TPCK胰蛋白酶的5ml培养基（RPMI1640）加入T-25烧瓶中。
血凝集测定（HA）
1. 准备培养上清，在PBS中连续稀释病毒。
2. 取50μl的每个稀释，并置于预标记的U底96孔板。
3. 向每个管中加入50μl的0.5％火鸡红细胞悬浮液，并通过搅拌混合
4. 允许管在室温下静置30分钟。
5. 30分钟后，记录结果。阴性管被视为位于管底部的细胞的完全轮廓的"按钮"。在管底部观察到不规则的细胞团的中间阳性结果。使用均匀的薄膜看到正面的结果，其缺乏覆盖管底部的明显形状

致谢

我们要感谢Kwok-Yung Yuen和Kelvin KW To为流感病毒H1N1毒株提供患者血浆，Hong-Lin Chen和Zhiwei Chen，以及含有全长H1N1 HA基因的重组质粒Dimiter S Dimitrov和Zhongyu Zhu pYD7酵母质粒和用于Raji细胞系的Martial Jaume。我们感谢Kwok-Yung Yuen，Kelvin KW To，Linqi Zhang，Qi Zhao，Li Liu和Jia Guo进行了有益的讨论，并与Yanyu Zhang和Jingjing Li取得了技术援助。这项工作得到了中国第12个5年大型项目（＃2012ZX10001006）和从香港大学到M-Y的小项目资金（＃201109176176和＃201007176258）的支持。 Z.

参考文献

Panda，S。和Ravindran，B。（2013）。人PBMC的分离。生物协议 3（3）：e323 。
Srivastava，V.，Yang，Z.，Hung，I.F.，Xu，J.，Zheng，B.and Zhang，M.Y。在大流行性H1N1流感病毒的血凝素抗原上鉴定显性抗体依赖性细胞介导的细胞毒性表位。 J Virol 87（10）：5831-5840。