材料和试剂

根癌土壤杆菌电感受态细胞（菌株GV3101）
（Icon Genetics GmbH，目录号：pICH38099）（Marillon et al。，2004; Giritch et al。，2006）。 br />
利福平（Sigma-Aldrich，目录号：R3501）
庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G1264）
卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：K1876）
酵母提取物（Fisher Scientific，目录号：BP1422）
营养肉汤（BD，目录号：231000）
UV/Vis比色杯（VWR International，目录号：77776-745）
MES（默克密理博公司，目录号：475894）
硫酸镁（EMD Millipore，目录号：MX0070-3）
磷酸钠（EMD Millipore，目录号：SX0710-1）
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
氢氧化钠
抗坏血酸（Fisher Scientific，目录号：BP351）
1M Tris缓冲液（pH 8.0）
甘氨酸（Fisher Scientific，目录号：BP381-5）
L-精氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5006）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Gibco ，目录号：14190-144）
LB琼脂平板（见配方）
YenB媒体（见配方）
渗透缓冲液（参见配方）
提取缓冲液（参见配方）
蛋白A洗脱缓冲液（参见配方）
蛋白A平衡/洗涤缓冲液（参见配方）
Phenyl HP平衡/清洗缓冲液（参见配方）
Phenyl HP洗脱缓冲液（见配方）

设备

Amicon超离心过滤器，30K（EMD Millipore，目录号：UFC903024）
电穿孔杯（USA Scientific，目录号：9104-1050）
瓶顶过滤器单元（VWR International，目录号：73520-986）
斜面烧瓶（VWR International，目录号：4446-500）
离心瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：3141-0250）
HiTrap Protein A HP柱（通用电气公司，目录号：17-0403-03）
Phenyl HP柱（通用电气公司，目录号：17-5195-01）
Multiporator（Eppendorf，Bacteria module，目录号：4308 805.005）
28℃孵育器（Fisher Scientific）
台式轨道摇床（Thermo Fisher Scientific，目录号：SHKE4450）
UV/Vis分光光度计（Beckman Coulter，目录号：DU800）
Avanti J-26 XP离心机（Beckman Coulter，目录号：393124）
渗透装置（Bel-Art Products，目录号：F420250000）
真空泵（William H.Welch Medical Library，目录号：8890A-75）
生长室
Blender（Waring Pro，目录号：7011HS）
AKTA净化器（通用电气公司，目录号：28-4062-66）

程序

用含有感兴趣mAb序列的植物表达病毒载体DNA质粒将电感受态农杆菌细胞在2,000V下转化5毫秒。
在28℃下振荡转化细胞1小时以建立抗生素抗性后，在LB琼脂平板（含有30μg/ml利福平，50μg/ml庆大霉素和50μg/ml卡那霉素）上划线细胞，并在28℃培养箱中生长 3 - 4天。
挑取单个转化的细菌菌落，并在5ml YenB培养基中加上30μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素，在28℃和225rpm下生长过夜。
将5毫升起始培养物转移到含有95毫升新鲜YenB培养基加上相同抗生素的大烧瓶中，并在28℃和225转/分钟生长过夜。
使用UV/Vis分光光度计，使用YenB介质作为空白，测量600nM的光密度。计算在所需的浸润缓冲液（1.6L）的总体积中最终OD 600等于0.03所需的大培养物的体积。
离心计算体积的细菌培养物在5,000×g，室温下15-30分钟。将沉淀的细菌重悬在任何体积的浸润缓冲液中，稀释至最终体积为1.6L 注意：例如，如果度量OD <600> 为1.25，则会进行以下计算
（1.25）x =（0.03）（1.6 L）
x = 38.4ml的细菌培养物需要离心，然后重新悬浮在浸润缓冲液中。
将重悬的细菌转移到真空装置中并填充至最终体积。对整个N的所有叶施加25英寸Hg的压力。本生烟草（在26-30天之间）2分钟，然后释放真空，导致细菌接种物进入叶子（图1）。相同的浸润缓冲液可以重复用于多达约16个植物，而没有任何明显的接种贬值。
注意：应努力防止植物土壤进入浸润缓冲液，但不会干扰成功感染植物。

图1.真空渗透。mAb载体通过 A递送。使用真空渗透（参见上述，步骤7），将叶片上的根瘤土壤转化为本氏烟草叶。
植物在浸润后生长与浸润前相同，在27℃和> 50％湿度，16小时白天/8小时夜间时间表。每隔一天给植物浇水。
在浸润后7天（dpi），通过在茎的基部切割叶并收集感染的表达mAb的叶，并测量总质量。与未接种的叶相比，接种后的叶可通过浸润4-5天后显示的马赛克表型来区别。
使用工业混合器在冷提取缓冲液中提取mAb，同时每1g叶组织混合2ml缓冲液注意：对于剩余的程序，请尽力确保mAb保持在4°C，包括提取和纯化。
将叶提取物在4℃下以15,000×g离心10分钟以沉淀植物碎片。
使用氢氧化钠将部分澄清的提取物的pH调节至7.0，并在4℃下以15,000×g离心10分钟以沉淀淀粉和小植物碎片。
提取的最后步骤需要使用真空使澄清的提取物通过0.2μm瓶顶过滤器。
mAb最初通过使用来自GE Healthcare的HiTrap Protein A HP柱在AKTA纯化器上通过FPLC纯化。该柱用10柱体积（CV）的蛋白A平衡/洗涤缓冲液平衡
mAb澄清的提取物以2ml/min加载。在将提取物加载到柱之后，使用蛋白A平衡/洗涤缓冲液（10CV）将未结合的蛋白从柱中洗出。
蛋白A洗脱缓冲液用于使用100mM蛋白A洗脱缓冲液的梯度梯度从蛋白A柱洗脱mAb达10个CV。使用1M Tris缓冲液（pH 8.0）将含有mAb的级分的pH从3.0调节至7.0 注意：步骤梯度被编程到方法运行中，使得AKTA纯化器在一个步骤中从0％洗脱缓冲液转换到100％洗脱缓冲液。
在蛋白A纯化后，使用来自GE Healthcare的HiTrap Phenyl HP柱。柱子在苯基HP平衡/洗涤缓冲液中用10CV平衡
蛋白A洗脱的mAb在Phenyl HP平衡/洗涤缓冲液中以1:10稀释，并以2ml/min加载。使用10 CV苯基HP平衡/洗涤缓冲液将未结合的蛋白从柱上洗去
Phenyl HP洗脱缓冲液用于使用从0％苯基HP洗脱缓冲液到30％CV的100％苯基HP洗脱缓冲液的线性梯度从柱中洗脱mAb，然后在100％苯基HP洗脱缓冲液中另外5个CV。 > 注意：线性梯度被编程到方法运行中，使得AKTA纯化器控制从0％洗脱缓冲液到100％洗脱缓冲液的递增转变，其中洗脱的整个长度为30CV。
将纯化的mAb配制在pH 7.2的dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中。通过在还原和非还原条件下过载的考马斯染色的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的密度测定法分析纯度。
活性通过抗原捕获酶联免疫吸附测定（ELISA），表面等离子体共振和体外病毒中和测定来确定。

食谱

LB琼脂平板上 30μg/ml利福平
50μg/ml庆大霉素
50μg/ml卡那霉素
YenB介质（1升）
酵母提取物7.5克
营养肉汤8.0 g
pH 7.0
高压灭菌器
渗透缓冲液
10 mM MES
10mM硫酸镁
pH 5.5
提取缓冲区
100 mM磷酸钠
100 mM氯化钠
40mM抗坏血酸
pH 6.0
蛋白A洗脱缓冲液
100 mM甘氨酸 200mM L-精氨酸 pH 3.0
蛋白A平衡/洗涤缓冲液
20 mM磷酸钠
pH 7.0
Phenyl HP平衡/洗涤缓冲液
50mM磷酸钠
1 M硫酸铵
pH 7.0
Phenyl HP洗脱缓冲液
50mM磷酸钠
pH 7.0

致谢

该方案改编自Hamorsky等人（2013）。 magnICON载体由Icon Genetics GmbH，Halle/Saale，Germany提供。这项工作部分由NIH R21/R33AI088585和路易斯维尔大学副校长办公室研究竞争力增强拨款（50730）到NM。

参考文献

Giritch，A.，Marillonnet，S.，Engler，C.，van Eldik，G.，Botterman，J.，Klimyuk，V.and Gleba，Y。（2006）。在用非竞争性病毒载体共感染的植物中快速高产量表达全长IgG抗体。 a> Proc Natl Acad Sci USA 103（40）：14701-14706。
Hamorsky，K.T.，Grooms-Williams，T.W.，Husk，A.S.，Bennett，L.J.，Palmer，K.E.and Matoba，N。（2013）。广泛中和抗HIV-1单克隆抗体VRC01的高效率单病毒载体生物制备>本尼巴烟草（Nicotiana benthamiana）植物和VRC01在组合杀微生物剂中的用途。 Antimicrob Agents Chemother 57（5）：2076-2086。
Matoba，N.，Davis，K.R。和Palmer，K.E。（2011）。 Nicotiana中的重组蛋白表达。方法Mol Biol 701：199-219。
Marillonnet，S.，Giritch，A.，Gils，M.，Kandzia，R.，Klimyuk，V.and Gleba，Y。（2004）。在植物中病毒RNA复制子的工程化：通过DNA重组的有效装配通过农杆菌递送的模块。 Proc Natl Acad Sci USA 101（18）：6852-6857。