材料和试剂

植物材料
4-硝基苯基乙酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：N8130）
4-硝基苯（Sigma-Aldrich，目录号：N1048）
Tris-HCl
EDTA
MgCl 2
来自Birchwood的Xylan（Sigma-Aldrich，目录号：X4252）
来自柑橘属水果的果胶（Sigma-Aldrich，目录号：P9436）
磷酸钠
氢氧化钠
羟胺盐酸盐（Acros Organics，目录号：5470-11-1）
高氯酸（Sigma-Aldrich，目录号：311421-50ML）
绝对甲醇
葡萄糖五乙酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：G2354-25G）
去离子水
Bio-Rad蛋白测定（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）（可选）
提取/反应缓冲液（参见配方）
重新暂停缓冲区（请参阅配方）
酸 - 酒精溶液（参见配方）
高氯酸铁试剂（MP Biomedicals，目录号：215875）（参见配方）

设备

锋利的剃刀刀片
pH计
微量滴定板读数器
微量离心机
离心机与15 ml小瓶相容
96孔微量滴定板
parafilm
锋利的剃刀刀片
10毫升注射器
轻水流实验室真空
SpeedVac干衣机
涡流
NanoDrop分光光度计（可选）
微量振荡器

程序

植物材料中的脂质体蛋白提取物
注意：乙酰酯酶活性测定不仅可应用于质外体蛋白，而且可应用于总蛋白提取物和纯化的酶。
1. 收获植物的2-5克地上部分（茎，叶，长角果，花和芽），并使用锋利的刀片立即切成5毫米的段。
2. 将植物材料放入10毫升的注射器，其尖端用Parafilm密封（图1A-B）。
3. 加入5 ml预冷的提取/反应缓冲液。
4. 将注射器放入离心管（尖端显示向下，图1C），并在真空器（图1D-E）中的真空处理两次，持续15分钟，在10℃的冷室中5分钟。
5. 打开注射器的尖端，小心地通过重力流动排出缓冲液并丢弃它。
6. 在10℃下以1,000xg离心10分钟。
7. 在冰上在管的底部聚集脂质体提取物。
8. 通过NanoDrop或通过在 Bradford蛋白测定（他，2011）。
  
  图1. Apoplast提取工具。初始设定：5ml注射器，15ml离心管，石蜡膜。 B.注射器尖端用石蜡膜密封。 C.将密封尖端的注射器置于离心管中。 D.具有密封尖端的注射器在离心管中放置在真空释放器中。 E.真空除尘器连接到真空管。
乙酰酯酶的总活性
1. 用提取/反应缓冲液稀释质外体提取物，得到0.128mg（100μl）注意：用于测定的蛋白质的量将根据提取物中存在的乙酰酯酶的酶活性和特异性而变化。在这里，我们执行拟南芥提取物。
2. 准备空白阴性对照，通过加入1微升的200mM pNP-乙酰基到100微升含有0.128毫克蛋白质煮沸10分钟的质外体提取物。
3. 加入1微升200毫米pNP乙酰基100微升稀释的质外体提取物。
4. 在室温下孵育0,5,15,30,60,120,180分钟读数空白，在每个时间点在微板读数器中在460nm处的样品吸光度。
5. 通过测量在0.1mM至2mM的系列浓度中稀释的100μlpNP溶液在460nm处的吸光度来制备标准曲线。所有稀释液以3次重复制备。计算将使STD1值等于0.1μmolpNP的吸光度的线的斜率。
6. 对于每个时间点测量OD <460>样品-OD <460>空白并计算斜率。
7. 使用以下公式计算释放的pNP的量：
  斜率/STD1 * 0.1/0.128
  斜率（来自步骤B6）
  0.1和STD1（从步骤B5）
  0.128（来自步骤B2）
  获得值将指示每1分钟每1mg质外体蛋白质释放的pNP微摩尔数
使用天然底物（细胞壁衍生的多糖）测定乙酰酯酶活性，
1. 在提取/反应缓冲液中加入0.12 mg的apopalst蛋白质至总体积为0.6 ml的20 mg天然底物。
2. 通过在提取/反应缓冲液中向20mg天然底物中加入0.12mg煮沸的质外体蛋白来制备空白阴性对照。
3. 在室温下孵育0,30分钟，1小时，3小时，6小时以130rpm振荡。
4. 在每个时间点离心多糖材料（在17,000×g下1分钟），并取100μl上清液。
  注意：在取等分试样之后，将沉淀物继续孵育。
5. 使用SpeedVac干燥等分试样。
6. 将干物质重新悬浮于40μlRe-悬浮缓冲液中（使用涡旋）。
7. 加入100μl去离子水，小心混合。
8. 加入100微升酸 - 酒精溶液，仔细混匀。
9. 加入260微升高氯酸铁试剂，仔细混合。
10. 在室温下孵育15-30分钟。
11. 测量510 nm处的吸光度。
12. 对于每个时间点测量OD <510>样品-OD <510>空白，并计算斜率。
13. 使用葡萄糖五乙酸酯制备标准曲线，在40μl溶液中进行从0.1mM至2mM的一系列稀释，接着从上面C7-12段。计算斜率，其将给出STD2值等于0.2nmoles乙酰基残基的吸光度。
14. 通过以下公式计算从天然底物释放的乙酰基的量：
  斜率* 0.2/STD2/0.02
  斜率（来自步骤C12）
  0.2和STD2（从步骤C8开始）
  0.02（总共6次测量中使用0.18mg的质外体蛋白）确定的值将表示每1分钟每1mg质外体蛋白质释放的乙酰基的量（nmoles）

食谱

提取缓冲区
25mM Tris-HCl
50mM EDTA
150mM MgCl 2（pH 7.4）
重新暂停缓冲区
0.25M羟胺盐酸盐 1M氢氧化钠溶液
酸 - 酒精溶液
5％高氯酸的无水甲醇溶液
高氯酸铁试剂
0.3％高氯酸铁（非黄色）
0.5％高氯酸溶于88％甲醇中

致谢

作者承认Carver Funding支持这项工作。

参考文献

他，F.（2011）。 Bradford蛋白质测定生物协议 1（6）：e45。
McComb，E。和McCready，R。（1957）。果胶和乙酰化碳水化合物聚合物中乙酰基的测定 Anal Chem 29（5）：819-821。
Pogorelko，G.，Lionetti，V.，Fursova，O.，Sundaram，R.M.，Qi，M.，Whitham，S.A。，Bogdanove，A.J.，Bellincampi，D.and Zabotina，拟南芥的和转基因植物的构巢曲霉乙酰酯酶具有降低的多糖乙酰化程度和增加的对病原体。植物生理学 162（1）：9-23。
Pogorelko，G.，Fursova，O.，Lin，M.，Pyle，E.，Jass，J.and Zabotina，O.A。（2011）。通过在质外体中表达微生物水解酶来合成修饰植物细胞壁。 Plant Mol Biol 77（4-5）：433-445。