材料和试剂

PIP-珠（Echelon）与相应的感兴趣的磷酸肌醇。 Echelon根据需要提供广泛的PI和其他磷脂包被的珠子，包括一个样品包，它有广泛的设备
1. 冷冻离心机
2. 振动或旋转振动器
3. 抽吸泵
4. 针0.7×30毫米
5. 1.5 ml试管
程序
1. 开始之前
  一个。准备或解冻纯化的GST蛋白 b。预冷离心机。
  C。准备洗涤/结合缓冲液。
  d。通过用钳子或类似工具切割针尖来制造抽吸尖端（图1）。这将使针直径最小化。
  
  图1.吸引提示
2. 每个蛋白使用50微升的PI珠。梯形提供悬浮在缓冲液50/50中的珠。
3. 用500μl预冷的洗涤/结合缓冲液在300×g，30秒下短暂洗涤三次珠子。
4. 将珠子在300×g，4℃下离心。
5. 向每个管中加入1ml洗涤/结合缓冲液与PI珠。
6. 添加2微克利息GST标记蛋白的PI珠。
7. 孵育GST标记蛋白或蛋白域与珠在室温下旋转2小时。对于一些蛋白质结构域，可能需要更长的孵育时间或过夜4℃的温育，这取决于所选结构域对磷酸肌醇的亲和力。
8. 通过离心（300-400×g 在4℃下）沉淀珠粒来洗涤珠子。然后加入1ml洗涤缓冲液，并重悬细胞。将管反转5次，并在4℃，300-400×g离心。小心吸出上清液，不要用针尖接触珠子。重复此过程5次。
9. 最后一次洗涤后，通过吸出干珠，立即加入100μl的2×Laemli缓冲液。
10. 将样品在95℃煮沸5-10分钟。
11. 现在，样品在SDS-PAGE中分析时可以保持在-20℃。
12. 在装载到SDS-PAGE凝胶中之前，以27,000×g离心样品5分钟。这将球粒。
13. 可以通过western印迹分析结合，通过抗GST抗体检测感兴趣的蛋白质或结构域。单独的GST控制不应产生任何种类的结合。
食谱
1. 洗涤/结合缓冲液
  10mM HEPES（pH7.4） 150mM NaCl 0.25％Igepal CA630
2. 2x Reducing * Laemmli Sample Buffer
  4％SDS
  20％甘油
  120 mM Tris-HCl（pH 6.8）
  5％β-巯基乙醇 0.2％溴酚蓝
  *重要的是缓冲液是还原和新鲜的，因为还原剂连同沸腾对于从磷酸肌醇珠洗脱蛋白质是必需的。
致谢

该协议改编自Galvez-Santisteban等人（2012）。

参考文献
1. Di Paolo，G.and De Camilli，P。（2006）。磷酸肌醇在细胞调节和膜中动态。 443（7112）：651-657。
2. Galvez-Santisteban，M.，Rodriguez-Fraticelli，AE，Bryant，DM，Vergarajauregui，S.，Yasuda，T.，Banon-Rodriguez，I.，Bernascone，I.，Datta，A.，Spivak，，K.，Slim，CL，Brakeman，PR，Fukuda，M.，Mostov，KE和Martin-Belmonte，F。（2012）。突触结合蛋白样蛋白控制上皮细胞中单个顶端膜结构域的形成。 Nat Cell Biol 14（8）：838-849
3. Martin-Belmonte，F。和Mostov，K。（2007）。磷酸肌醇控制上皮发育。细胞周期 6（16 ）：1957-1961。
4. Szentpetery，Z.，Varnai，P。和Balla，T。（2010）。急性操作高尔基磷酸肌醇，以评估其在细胞运输和信号传导中的重要性。 > Proc Natl Acad Sci USA 107（18）：8225-8230。