材料和试剂

HCV NS5B抑制剂
纯化的重组HCV NS5BΔC21可溶性蛋白[根据Boyce等人（2014）和Hung等人（2011）克隆和纯化]
ProteOn GLH传感器芯片（Bio-Rad Laboratories，目录号：176-5013）
HEPES溶液（1M）（Sigma-Aldrich，目录号：H3537-1L）
MgCl 2（1M）（Sigma-Aldrich，目录号：M1028-100ML）
EDTA（0.5M）（Sigma-Aldrich，目录号：E7889-100ML）
NaCl（5M）（Sigma-Aldrich，目录号：S6546-1L）
KCl（2M）（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM9640G）
三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）（Sigma-Aldrich，目录号：C4706-10G）
表面活性剂P20（10％v/v）（General Electric Company，目录号：BR-1000-54）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：472301-100ML）
含有1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDAC或EDC），磺基-N-羟基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）和乙醇胺-HCl的蛋白质偶联试剂盒（Bio-Rad Laboratories，目录号：176-2410）
预处理试剂（参见配方）
固定缓冲液（参见配方）
运行缓冲区（参见配方）
用5％DMSO运行缓冲液（见配方）

设备

ProteOn标准& 深孔微孔板（Bio-Rad Laboratories，目录号：176-6020和176-6023）
Proteon微孔板密封膜（Bio-Rad Laboratories，目录号：176-6040）
Nalgene快速过滤器和瓶顶过滤器，PES膜，无菌（VWR国际，目录号：16211-056）（1升尺寸）
ProteOn XPR36仪器（Bio-Rad Laboratories）
微量离心管的BenchTop离心机
BenchTop离心机旋转ProteOn 96孔测定板

软件

Proteon管理软件版本3.1.0.6
用于ProteOn数据分析（BioLogic软件）的Scrubber软件

程序

用蒸馏水灌注系统。使用100mM HCl，50mM NaOH，0.5％SDS和10％DMSO各1分钟脉冲，使用30μl/min的流速在水平和垂直方向上预处理GLH芯片。密封所有与ProteOn密封膜一起使用的微孔板
使用运行缓冲区填充系统。使用制造商规定的EDC和sulfo-NHS在垂直方向上激活所有6个配体通道（L1-L6），流速为30μl/min，接触时间为5分钟。
在固定化缓冲液中稀释NS5B蛋白至浓度为30μg/ml，并以30μl/min的流速在垂直方向上注入配体通道5分钟，以获得5,000-10,000RU的固定化蛋白质（参见笔记）。将L1通道打开为参考通道。
当计算理论最大响应时，应考虑蛋白质的活性。 R sub max被计算为R sub（MW sub/MW sub）* n，其中R sub L sub等于固定的配体的量，MW sub是分析物的分子量，MW sub是配体的分子量，并且n是每个配体分子的结合位点的数目。假设单位点结合（即n = 1），具有500Da的平均分子量的小分子分析物与由10,000RU的NS5BΔC21（MW〜64,300Da）组成的表面相互作用应当产生约78RU（即10,000RU/500Da/64,300Da）的理论R submax或如果表面仅为50％活性的39RU。
通过以30μl/min的流速注射乙醇胺-HCl 5分钟，停用所有垂直通道（L1-L6）。
旋转多通道模块（MCM），因为所有后续进样都将在水平方向上进行。用含有5％DMSO的运行缓冲液填充系统，并使用该缓冲液注入缓冲液三次有助于在旋转后稳定系统
为了说明排除的体积效应，注射4.5％和5.5％之间的一组五种溶液（DMSO浓度系列）用于软件以产生DMSO排除体积校准（EVC）曲线。通过向3,000μl含有5％DMSO的运行缓冲液中加入333μl运行缓冲液，向15μl含有5％DMSO的运行缓冲液和4.5％DMSO溶液中加入15μl100％DMSO制备5.5％DMSO溶液。根据下面所述的体积混合5.5％和4.5％DMSO溶液以获得五种不同的溶液。进行五次单独的注射以产生各自对应于一种DMSO溶液的注射的DMSO浓度系列。软件将使用这一系列进样来生成DMSO校准曲线，以校正排除的体积效应 5.5％DMSO缓冲液4.5％DMSO缓冲液 1200μl                0微升
900μl                      300微升
600μl       600μl
300μl                      900μl
0μl       1200μl
当设计分析物注射序列时，在每次注射化合物之间包括缓冲液注射（或在96孔板中的空间允许）。
解冻化合物，通常储存在-20℃的微量离心管中的100％DMSO中，并在微量离心机中快速旋转它们。
在DMSO中连续稀释化合物，以达到所需最终测定浓度的20倍的一组五个浓度（在本实施例中为四倍稀释）。将稀释液转移到含有适当体积的运行缓冲液的微量培养板中的孔中，以产生5％的最终DMSO浓度（即，匹配运行缓冲液中的DMSO与DMSO的％）。这些将作为分析物A2-A6注入。向相同体积的运行缓冲液中加入100％DMSO至对应于注射分析物A1的孔，得到5％的最终DMSO浓度。从井A1的注入将作为空白并用于双参考数据。
使用快速15-30秒脉冲离心板，以确保收集粘在微孔板孔壁上的任何化合物溶液。
以100μl/min注射化合物，接触时间为90秒，可变解离时间为60秒至1小时（根据单个化合物的需要）。在没有关于化合物的亲和力的任何知识的情况下，可能必须进行涉及以单一浓度注射的初步实验，以便测量每种化合物的最佳解离时间。
数据可以使用ProteOn软件分析，但也可以使用为ProteOn数据设计的Scrubber软件版本进行分析。双重参考所有信号（使用L1和A1），并通过应用DMSO校准曲线校正排除的体积效应
所有测试浓度的传感图应当同时拟合，即全局。一般来说，数据应始终首先适合于产生平衡解离的简单的1：1动力学模型常数（K D），表面的最大结合电容R submax（其可以不同于理论最大结合电容）和缔合的速率常数（ k _a）和解离（ k _d）。在简单的1：1动力学模型中，单个值， k _{d < max}。 Scrubber和ProteOn拟合程序都解决了参数 k _a和 k _d。然后将K 计算为 k / k _a的比率。应明确说明使用其他需要多个值的更复杂模型。菲律宾与NS5BΔC21结合（见图1）是显示简单的1：1动力学的小分子结合的实例。

图1. Filibuvir与NS5BΔC21的结合。显示Filibuvir结合的传感图。在（从顶部到底部）4μM（橙色），1μM（粉红色），0.25μM（绿色），0.0625μM（蓝色）和0.0156μM（青色）的浓度下，将Filibuvir注射90秒的接触时间。监测解离180秒。数据的拟合以实线显示。

笔记

使用的生理固定缓冲液可以容易地将足够的NS5B酶预浓缩在羧基表面上。当选择在HEPES缓冲盐水中稀释蛋白质而不是标准低pH（5.5）10mM乙酸钠固定缓冲液时，NS5BΔC21的配体活性从45％增加至99％。

食谱

预处理试剂
100 mM HCl
50 mM NaOH
0.5％SDS
10％DMSO
固定缓冲液
10mM HEPES（pH7.5） 150mM NaCl 过滤灭菌（0.45μm）
运行缓冲区
50 mM HEPES
5mM MgCl 2/
10 mM KCl
1mM EDTA
1 mM TCEP
0.01％P 2 O 用NaOH调节pH至7.5 将dH ₂ O添加到所需的量
过滤灭菌（0.45μm）
用5％DMSO运行缓冲液
向运行缓冲液中加入100％DMSO至最终浓度为5％DMSO 例如，将50ml DMSO加入运行缓冲液至总体积为1L。

致谢

此协议的简要描述以前出现在Boyce等人（2014）。

参考文献

Boyce，SE，Tirunagari，N.，Niedziela-Majka，A.，Perry，J.，Wong，M.，Kan，E.，Lagpacan，L.，Barauskas，O.，Hung，M.，Fenaux，，Appleby，T.，Watkins，WJ，Schmitz，U.and Sakowicz，R。（2014）。 HCV NS5B聚合酶（β环和C末端尾）的结构和调节元件是活性的变构拇指位点II抑制剂。 9（1）：e84808。
Hung，M.，Wang，R。和Liu，X。（2011）。制备用于支持小分子药物发现的HCV NS3和NS5B蛋白。 Curr Protoc Pharmacol 第13章：Unit13B 16.