材料和试剂

基质细胞（MS5细胞或OP9细胞）
生长因子
一个。 rm SCF（10ng/ml）（例如，R& D systems，目录号：455-MC-010）。
b。 rm Flt3-配体（20ng/ml）（例如R& D systems，目录号：427-FL-025）
C。 IL-7（1ng/ml）（例如R& D systems，目录号：407-ML-005）。
抗体
一个。抗小鼠Mac1（BD Biosciences，目录号：557396）
b。 Gr1（BD Biosciences，目录号：553128） C。 CD19（BD Biosciences，目录号：557399） d。 CD45R/B200（BD Biosciences，目录号：553092） e。 CD45（BD Biosciences，目录号：550994）
胰蛋白酶/EDTA溶液（Nacalai Tesque，目录号：35554-64）
EDTA溶液（Nacalai Tesque，目录号：14367-74）
Eagle培养基的Alpha修饰（Corning，cellgro ，目录号：50-012）
最小必需培养基α培养基（目录号：41061-029）
FCS（MP Biomedicals，目录号：2916754）
L-谷氨酰胺（Corning，cellgro ，目录号：61-030）
青霉素 - 链霉素（Nacalai Tesque，目录号：26253-84）
MS-5生长培养基（参见配方）
OP-9生长培养基（参见配方）

设备

具有自动细胞沉积系统的细胞分选机（BD Biosciences，FACSAria ^TM）
96孔平底板
10厘米塑料碗
CO <2>孵化器
流式细胞术系统

程序

在10厘米的培养皿中生长基质细胞至亚汇合状态。使用MS-5生长培养基培养MS-5基质细胞。使用OP-9生长培养基生长OP-9基质细胞。
用PBS洗涤基质细胞两次，并用胰蛋白酶/EDTA溶液在37℃下胰蛋白酶消化5分钟。通过吸移分离细胞。在300×g离心5分钟后，将细胞重新悬浮在生长培养基中。在开始共培养前一天将一半来自10cm培养皿的细胞接种到一个96孔板中。当将其接种到96孔板中时，基质细胞的密度和体积为40〜50细胞/ml和50 ml /孔。
准备测试淋巴母细胞祖细胞。（根据每个实验的目的，测试祖细胞应该不同。）将具有不同密度的祖细胞（例如每个孔1,2,4,8,16,32,64个细胞）置于制备的基质层上，使用细胞分选机。在补充有10％FCS，rmSCF（10ng/ml），rmFlt3-配体（20ng/ml）和rmIL7（1ng/ml）的Eagle's培养基的α修饰中的基质细胞上培养祖细胞。
通过去除一半培养基并用新鲜培养基替换来每周喂养两次培养物。每次喂养时应新鲜加入细胞因子。
在培养10天时，检查孔中是否存在造血克隆。收获阳性孔，并通过流式细胞术分析CD45 +/+造血细胞，CD45R/B220 +和CD19 +/+ Mac1阳性细胞的存在。（和/或Gr1 ^-）B-谱系细胞和Mac1 ⁺（和/或Gr1 ⁺）髓系细胞（图1）。

图1.上面显示的是流式细胞术的代表性图谱，显示Mac1和CD19在恢复的CD45 ⁺ 细胞上的表达横田等 al。，2009）
通过基于泊松分布的线性回归分析计算确定祖细胞的频率。频率作为导致37％阴性培养物的测试细胞浓度的倒数给出。参见图2的示例。

图2.造血细胞和B谱系细胞的半对数图由阴性培养物的％作为输入ESAM 剂量的函数， sup> 细胞和3.5个ESAM sup/Lo细胞中的1个产生CD45 +血细胞，表明两个群体都是造血祖细胞的有效来源（左）。然而，尽管8个ESAM sup细胞中有1个产生CD19 sup + B谱系细胞，但在125个ESAM sup/Lo细胞中只有1个产生B细胞在这些条件下（右）（来自Yokota et al。，2009）的谱系细胞。

食谱

MS-5生长培养基
Eagle氏培养基的Alpha修饰
10％FCS
2mM L-谷氨酰胺青霉素 - 链霉素
OP-9生长培养基
最低必需培养基中度
20％FCS
青霉素 - 链霉素

致谢

该协议改编自我们先前发表的论文Satoh等人（2013）和Yokota等人（2009）。方案中所示的代表性数据来自Yokota等人（2009）。

参考文献

Satoh，Y.，Yokota，T.，Sudo，T.，Kondo，M.，Lai，A.，Kincade，PW，Kouro，T.，Iida，R.，Kokame，K.，Miyata，T.，Habuchi ，Y.，Matsui，K.，Tanaka，H.，Matsumura，I.，Oritani，K.，Kohwi-Shigematsu，T.and Kanakura，Y。 Satb1蛋白指导造血干细胞向淋巴谱系分化。免疫 38（6）：1105-1115。
Yokota，T.，Oritani，K.，Butz，S.，Kokame，K.，Kincade，P.W.，Miyata，T.，Vestweber，D.and Kanakura，Y。内皮抗原ESAM在小鼠的整个生命中标记原始造血祖细胞。血液 113（13）：2914-2923。