材料和试剂

肿瘤细胞（特别地，该方案针对A375P，MC-1，MA-2，WK-Mel和B16黑素瘤细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞建立）
CD1无胸腺裸鼠（6至9周龄）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，Gibco ，目录号：15400-054）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：41648）
CellTracker ^TM Orange CMRA（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：C34551）; 或者肿瘤细胞本身需要表达红色荧光蛋白（RFP）
4％多聚甲醛（PFA）在PBS中的溶液
30％蔗糖的PBS溶液
冷冻树脂（Killik，Bio-Optica Milano SpA，目录号：05-9801B）
异戊烷
干冰
染色血管的抗CD31抗体（BD Biosciences，目录号：550274）或抗Von Willebrandt因子抗体（Dako，目录号：A0082）
抗大鼠或抗兔Alexa-Fluor-488二抗（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：A11006和A11008）
FBS（Beromed，GmbH）
无血清培养基（见配方）
完全培养基（Life Technologies，Gibco ^®）（参见配方）

设备

细胞培养设置，层流罩，离心机，细胞计数室
50ml管子
P1000和P200提示
鼠标外壳和处理设置
带29 G x 1/2英寸针的U-100注射器
剪刀柄直凯利止血钳
荧光立体显微镜（例如，徕卡显微系统公司，型号：MZ16F）
冷冻切片机
荧光显微镜（例如具有ApoTome模块的ZEISS AxioObserver）
Burker计数室（Marienfeld-superior）

软件

图像分析软件（例如 ImageJ， http://rsbweb.nih.gov/ij/）

程序

从含有80-90％的肿瘤细胞（根据您的目的转染/处理）的80-90％铺满单层的皿或孔中移除培养基，用PBS洗涤细胞，并通过与1ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA孵育3 -8分钟;用完全培养基终止胰蛋白酶消化。
（仅用于非荧光细胞）以800rpm/100rcf旋转细胞3分钟，并将沉淀物重悬于50ml管中的3-4ml无血清培养基中。
（仅用于非荧光细胞）重悬在9.1μlDMSO中的整个冻干的CellTracker TM Suppress Orange CMRA，并加入3-4μlCellTracker TM sup Orange TM CMRA （1：1,000稀释）加入每个管中的细胞。在37℃孵育35-45分钟。在孵育期间，每10-15分钟轻轻摇动试管。
（仅用于非荧光细胞）以800rpm/100rcf旋转细胞5分钟，并将沉淀物重悬在15-25ml PBS中，取决于初始融合。由于跟踪器的合并，单元格将显示为粉红色/红色。
用布尔计数室计数细胞。
准备注射用的细胞混合物。您将在每只小鼠200μlPBS的体积中注射1至1.7×10 6个细胞。每只小鼠注射的细胞数目应事先由研究者在试验性实验中确定，并且主要取决于细胞类型，大小，侵袭性和形成细胞簇的倾向。例如，我们注射1×10 6个B16细胞，其是极度转移的并且易于形成大的簇和1.6×10 6个 A375P细胞，其较小且转移性较小。
根据您将注射的小鼠数量，旋转（在800 rpm/100 rcf 3分钟）您的实验所需的适当数量的细胞。通过吸取细胞悬液上下数次用P1000和P200尖端重悬细胞在PBS中，并保持管在冰上直到注射。为了避免细胞簇形成，其对于小鼠是潜在危险的，并且可能在外渗期间改变细胞行为并干扰分析，所以细胞处于均一的单细胞状态是必要的。
加热CD1裸鼠在红灯下几分钟，以获得血管舒张，更容易处理。使用具有29G×1/2英寸针的U-100注射器在外侧尾静脉中注射200μl的每只小鼠的细胞混合物（1.4至1.7×10 6个细胞）。
在注射后的早期时间点，作为"加载对照"（10分钟至2小时）和在稍后的时间点（12小时至72小时）分析小鼠肺（如步骤10-14所示）以检测外渗细胞。对于黑色素瘤（例如，A375P，WK-Mel）和乳腺癌（例如，MDA-MB-231）细胞，我们分别在2小时和48小时进行分析（参见图1）。

图1.肺外渗显微镜和显微镜分析。 A，D。在尾静脉注射CMRA标记的（红色）黑素瘤细胞后，全肺的代表性图片2小时（A）或48小时在裸鼠中。条：500μm。 B，C，E，F。鼠肺部切片的2小时（B，C）或48小时（E，F）后注射的代表性区域，CMRA-标记的（红色）黑色素瘤细胞，对Von Willebrandt因子染色以突出血液血管（绿色）并用DAPI（蓝色）进行反染色。酒吧：30μm
通过颈部脱位牺牲小鼠，通过消除气管周围的所有结缔组织，解剖动物胸部以用尖锐的显微切割镊子和剪刀暴露气管，直到白色软骨环是明显可见的。值得非常轻轻地进行，以避免气管穿孔。在隔膜上做纵向切口（但没有完全打开胸部），以允许肺部充气。使用止血钳夹住气管最多的头部，轻轻地注射0.8-1毫升冰冷的4％PFA在气管内用U-100注射器与29 G x 1/2英寸针，平行于气管的针头。你会清楚地看到肺膨胀。完成解剖并拔出肺。
在清洁的PBS中短暂清洗整个肺，以消除血液，并将其固定在8-10毫升的4％PFA内15毫升管在4℃下2-3小时。不要超过5小时否则荧光背景将扰乱您的分析。
在荧光立体显微镜下拍摄全肺的照片（至少3个视野/肺）。特别地，在干净的PBS中冲洗肺，并在纸巾上消除多余的液体，然后将整个器官在显微镜下放置在共同的细胞培养皿（没有盖子）中。在早期时间点，细胞将显示为沿着肺脉管系统设置的几个红色荧光团，以及在晚期时间点的分散小点，如图1A和1D所示。
通过借助于图像分析软件（例如，ImageJ， http://rsbweb.nih.gov/ij/）。

为了验证肺内肿瘤细胞的精确定位，应进行显微镜分析。

在PBS中大量洗涤固定的肺，并在30％蔗糖溶液中在4℃下将其脱水至少24小时。
包括肺在冷冻树脂在自制锡箔模具在干冰冷（约-50℃）异戊烷和存储在-80℃。
在带电载玻片上以6μm厚的切片冷冻切片。
对于免疫荧光染色，解冻载玻片，在PBS中冲洗它们，并通过使用PAP笔在样品周围形成疏水屏障。
注意：或者，您可能需要将样本在丙酮中后固定5-8分钟，以减少组织损失的风险，但避免使用甲醛衍生的固定剂）。
1. 然后将样品在室温（RT）下在5％牛血清白蛋白（BSA）中封闭1小时
2. 与抗CD31或抗Von Willebrandt因子抗体（分别为1:100或1:50稀释）一起在室温下孵育1小时或在4℃下过夜，在PBS中漂洗3次。
3. 在室温下用抗大鼠或抗兔Alexa-Fluor-488（绿色）第二抗体（1:500稀释）温育45分钟。
4. 用核标记物例如DAPI复染色，最后在PBS中漂洗并通过安装盖玻片来保护。
5. 使用标准荧光显微镜检查标本。代表图像如图1B-F所示。

食谱

无血清培养基
补充有1mM丙酮酸钠，25mM HEPES（pH 7.4）和100μg/ml庆大霉素的DMEM Glutamax TM sup。
完成媒介
补充有10％热灭活的FBS，1mM丙酮酸钠，25mM HEPES（pH 7.4），100μg/ml庆大霉素（用于MDA-MB-231）和用1×MEM Non（Invitrogen）的DMEM Glutamax TM - 必需氨基酸（用于WK-Mel和B16）和1x MEM非必需氨基酸和1x MEM维生素溶液（用于A375P，MC-1和MA-2）

致谢

该方法改编自Casazza等人（2011）。我们感谢Andrea Casazza在协议开发过程中的建议。我们也感谢Francesca Orso有益的讨论。我们的工作得到Compagnia San Paolo（2008.1054/DT），PRIN 2008/DT，AIRC 2010（IG10104/DT）和FIRB giovani 2008（RBFR08F2FS-002/FO）的资助。 Elisa Penna是FIRC研究员（2012-2014）。

参考文献

Casazza，A.，Finisguerra，V.，Capparuccia，L.，Camperi，A.，Swiercz，JM，Rizzolio，S.，Rolny，C.，Christensen，C.，Bertotti，A.，Sarotto，，M.，Trusolino，L.，Weitz，J.，Schneider，M.，Mazzone，M.，Comoglio，PM和Tamagnone，L。（2011）。 Sema3E-Plexin D1信号驱动小鼠的人类癌细胞侵袭和转移扩散。 em> J Clin Invest 121（7）：2945。

Penna，E.，Orso，F.，Cimino，D.，Vercellino，I.，Grassi，E.，Quaglino，E.，Turco，E.and Taverna，D。（2013）。 miR-214协调黑素瘤进展通过上调ALCAM通过TFAP2和miR-148b下调。 Cancer Res 73（13）：4098-4111。

Penna，E.，Orso，F.，Cimino，D.，Tenaglia，E.，Lembo，A.，Quaglino，E.，Poliseno，L.，Haimovic，A.，Osella-Abate， C.，Pinatel，E.，Stadler，MB，Provero，P.，Bernengo，MG，Osman，I.and Taverna，D。（2011）。 microRNA-214通过抑制TFAP2C促进黑色素瘤肿瘤进展 EMEMO J（10）：1990-2007。