材料和试剂

C57BL/6小鼠或选择的小鼠模型（Harlan Laboratories，目录号：057; Charles River Laboratories International，目录号：BLCSIFE49D）
工业甲基化酒精（IMS）（Lennox Laboratory Supplies，目录号：CRTS10330716）
无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14190）
RPMI 1640培养基（Life Technologies，Gibco ，目录号：31870）
胎牛血清（FCS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10270）
青霉素/链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G7513）
重组干细胞因子（SCF）（Sigma-Aldrich，目录号：S9915）
重组小鼠白细胞介素3（IL-3）（Merck KGaA，目录号：407631）
台盼蓝染料（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
APC偶联的c-kit（eBioscience，目录号：17-1171）
Fitc congugted-FcεRI（eBioscience，目录号：11-5898）
完成RPMI（参见配方）
生长因子（参见配方）
木村染料（见配方）
甲苯胺蓝溶液（参见配方）
饱和皂苷（见配方）
NaH 2 PO 4溶液（参见配方）。

设备

无菌钳
无菌剪刀
无菌移液器
注射器（10ml）
针（19号）
Falcon管（15或50ml）
水浴
pH计
离心机
37℃，5％CO 2培养箱
T25细胞培养瓶（SARSTEDT AG，目录号：83.1810.502）
血细胞计数器
安全柜

程序

注意：所有程序均在无菌环境下在安全柜中进行。

第1天

通过颈椎脱臼杀死老鼠。
用70％酒精（或IMS）彻底地喷洒小鼠，放在70％酒精浸泡的纸上
在小鼠的胸骨下方做一个小切口，将毛皮从胸部剥离。小心不要刺伤腹膜。使用无菌剪刀和镊子
使用带有19号针的10ml注射器，将1ml空气和10ml冰冷无菌PBS注入小鼠的腹膜腔。
注意：1：1的空气和PBS的混合物也可以用来避免泄漏。
不要取下针。
用手指给鼠标两侧30秒的按摩。小心不要用力过猛。
用注射器将带有细胞的PBS收集到Falcon管中。
注意：可以更换一个更大的针，从腹膜腔收集细胞。
用新的剪刀和镊子打开腹腔，用无菌移液管收集PBS的其余部分。
将Falcon管置于冰上直至离心
在4℃下用300×g离心细胞10分钟
重悬细胞在每只小鼠5ml PBS中
在4℃下用300×g离心细胞10分钟
将细胞重悬于5ml培养基[每2只小鼠10ng/ml IL-3和30ng/ml SCF（每只小鼠获得约100万细胞）]中，并将其转移到小培养瓶中。
将烧瓶放入培养箱（37℃，5％CO 2）中

第3天

通过弃去培养基除去非贴壁细胞，并向每个烧瓶中加入5ml新鲜培养基（含10ng/ml IL-3和30ng/ml SCF）。
将它们放回培养箱（37℃，5％CO 2）中。

第6天

向每个烧瓶中加入5ml新鲜培养基（含10ng/ml IL-3和30ng/ml SCF）

第9或10天

PCMC是非粘附细胞，可用于实验
细胞数和存活率可以用血球计中的台盼蓝染色测量
可以通过将细胞悬浮液和Kimura染料（1:1）混合并在37℃下在光学显微镜下计数细胞5分钟后用Kimura染色测试纯度。肥大细胞将被染成红色/紫色（Kimura等人，1973）。
注意：培养后预期的细胞数为0.5-1.5×10 6 PCMC /小鼠。纯度> 95％（图1）。

图1.培养9天后，腹膜来源的培养的肥大细胞的纯度超过95％。在10ng/ml的IL-10存在下，在完全RPMI培养基中培养腹膜细胞9天， 3和30ng/ml SCF。如先前所述，通过流式细胞术测量APC-缀合的c-kit和Fitc congugted-FcεRI细胞表面表达的基础上评估纯度（Vukman等人，2013）。 A：未染色对照; B：双重染色样品

食谱

完成RPMI
RPMI 1640（500ml） 10％FCS（50ml/450ml IMDM） 5ml青霉素（100U/ml）/链霉素（100μg/ml） 1 M 2-巯基乙醇（对于50μM终浓度，加入25μl至500ml）
生长因子（使用前添加到完全培养基中）
小鼠SCF（30μg/ml）
小鼠IL-3（10μg/ml）
木村染料
甲苯胺蓝溶液（50ml）饱和皂苷（2.27ml）
NaH 2 PO 4溶液（22.7ml）中
甲苯胺蓝溶液
甲苯胺蓝（25mg）（0.5mg/ml）
1.8％NaCl（18g/L）（25ml）（9g/L）乙醇（100％）（11ml）（22％）总共50ml ml
饱和皂苷
皂苷（200mg）（4mg/ml）
乙醇（50％）（50ml）总共50ml ml
注意：加热和涡旋30分钟。
NaH 2 PO 4溶液
60mM NaH 2 PO 4（1.03g）
总共100ml（pH 6.4）

致谢

本文描述的方案用于和改编自以下出版物（Vukman等人，2012）。

参考文献

Hochdorfer，T.，Kuhny，M.，Zorn，C.N.，Hendriks，R.W.，Vanhaesebroeck，B.，Bohnacker，T.，Krystal，G.and Huber， PI3K通路的激活增加TLR诱导的TNF-α和IL-6，但减少IL-1beta 生产在肥大细胞中。细胞信号 23（5）：866-875。
Kimura I.，Moritani Y.and Tanizaki Y.（1973）。 Basophils in bronchial asthma with reference to regain-type allergy。 Clin Allergy 3（2）：195-202。
Matsushima，H.，Yamada，N.，Matsue，H。和Shimada，S。（2004）。 TLR3-， TLR7-和TLR9介导的促炎细胞因子的产生来自鼠结缔组织型皮肤来源的肥大细胞的趋化因子但不是来自骨髓来源的肥大细胞。 J Immunol 173（1）：531-541。
McCurdy，J.D.，Lin，T.J.and Marshall，J.S。（2001）。 Toll样受体4介导的鼠肥大细胞活化。 Leukoc Biol 70（6）：977-984。
Mrabet-Dahbi，S.，Metz，M.，Dudeck，A.，Zuberbier，T.and Maurer，M。（2009）。鼠肥大细胞分泌一个独特的细胞因子和前列腺素响应不同的TLR2配体配置文件。 Exp Dermatol 18（5）：437-444。
Supajatura，V.，Ushio，H.，Nakao，A.，Okumura，K.，Ra，C.and Ogawa，H。（2001）。肥大细胞对肠道细菌感染的保护作用由Toll样受体4介导。
Sur，R.，Cavender，D.and Malaviya，R。（2007）。研究肥大细胞功能的不同方法 Int Immunopharmacol 7（5）：555-567
Vukman，K.V.，Visnovitz，T.，Adams，P.N.，Metz，M.，Maurer，M。和O'Neill，S.M。（2012）。从IL-3处理的小鼠培养的肥大细胞显示对细菌抗原刺激的受损反应。 Inflamm Res 61（1）：79-85
Vukman，K.V.，Adams，P.N.，Metz，M.，Maurer，M。和O'Neill，S.M。（2013）。 Fasciola hepatica tegumental coat损害肥大细胞驱动Th1免疫反应的能力。 J Immunol 190（6）：2873-2879。
Vukman，K.V.，Metz，M.，Maurer，M。和O'Neill，S.M。（2014）。骨髓衍生的肥大细胞的分离和培养生物协议 4（4）：e1053。