材料和试剂

C57BL/6小鼠或选择的小鼠模型（Harlan Laboratories，目录号：057; Charles River Laboratories International，目录号：BLCSIFE49D）
工业甲基化酒精（IMS）（Lennox Laboratory Supplies，目录号：CRTS10330716）
WEHI-3条件培养基由WEHI-3细胞系（ATCC，目录号：TIB68）产生
无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14190）
IL-3（BioLegend，目录号：432101）
IMDM与L-谷氨酰胺（Life Technologies，Gibco ，目录号：12440）
胎牛血清（FCS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10270）
青霉素/链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140）
巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
台盼蓝染料（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
完成IMDM（请参阅配方）
生长因子（参见配方）
木村染料（见配方）

设备

无菌钳
无菌剪刀
无菌移液器
注射器（10ml）
针（19，21和27号）
Falcon管（50ml）
细胞刮刀（SARSTEDT AG，目录号：83.1830）
Filtropur S 0.45过滤器（SARSTEDT AG，目录号：83.1826）
培养皿（100x20mm）
PD100培养皿
水浴
离心机
T75细胞培养瓶（SARSTEDT AG，目录号：83.1813.502）
T175细胞培养瓶（SARSTEDT AG，目录号：83.1812.502）
血细胞计数器
安全柜

程序

注意：所有程序均在无菌环境中在II级安全柜中进行。

制备WEHI-3条件培养基
1. 通过在37℃的水浴中孵育细胞2分钟，使来自储备液（其储存在液氮中）的细胞解冻。
2. 重悬细胞在37℃完全IMDM尽快。最终细胞数必须是2×10 5个细胞/ml和在37℃，5％CO 2下的T75组织培养瓶中的培养细胞。
3. 通道：将培养基从组织培养瓶转移到50ml Falcon管中
4. 用无菌细胞刮刀刮细胞
5. 将刮取的细胞转移到同一个50ml Falcon管中
6. 计数细胞，浓度必须> 6×10 5细胞/ml
7. 以300×g离心细胞5分钟。
8. 将上清转移到新的Falcon管中
9. 将细胞重悬在新鲜的完全IMDM（2×10 5细胞/ml）中
10. 将板细胞转移到新烧瓶（T75/T175）中
11. 将上清液再次以600×g离心15分钟
12. 将上清液转移并过滤到新的Falcon管中
13. 取0.5 ml用于通过商业ELISA测量IL-3浓度。浓度应介于10至100 ng/ml之间，最低浓度应为10 ng/ml
14. 在-20℃下冷冻上清液
15. WEHI-3条件培养基可以在步骤A3-14之后每3-4天收获。单元格编号不应超过2 x 10 ⁶。
BMMC的分离和培养
第0天[通道（P）1]
1. 通过颈椎脱臼杀死老鼠。
2. 用70％酒精（或IMS）彻底地喷洒小鼠，放在70％酒精浸泡的纸上
3. 使用两套无菌镊子和剪刀，一个用于鼠标的外皮，另一个用于去除腿（胫骨和股骨）。
4. 在小鼠的胸骨下面做一个小切口，切开皮肤远离前面的后面，使一个完整的圆。将毛皮完全从鼠标的下半部分剥离，使腿露出来。
5. 使用第二对剪刀和镊子。用食指和中指以及无名指和拇指之间的感兴趣的腿握住尾部，以直线切割方式将肌肉远离围绕髋部的后腿切开，以使髋关节适于切割。
6. 切开髋关节，以从鼠标的身体释放腿。小心不要切开，因此暴露股骨的骨髓。对鼠标的第二个腿重复此操作。
7. 剪下每条腿的脚踝以移除脚，并丢弃它们。
8. 将腿放置在冰上的部分填充有IMDM的50ml管中，直到下一步骤
9. 将腿放在PD100培养皿的一半上，并使用镊子和剪刀去除残余的肌肉，脂肪和结缔组织。
10. 切开膝关节，分开股骨和胫骨
11. 使用新鲜的钳子和剪刀在每端依次切割骨头，暴露骨髓
12. 使用填充有具有27号针的冰冷的介质的10ml注射器将骨髓冲洗到培养皿上。对所有骨骼重复此操作。
13. 使用19号针头打破并通过移液器悬挂骨髓。
14. 将骨髓悬浮液转移到50ml管中，并在300×g离心10分钟。
15. 弃去上清液并将细胞重悬在培养基（含有30％WEHI-3条件培养基的IMDM; 20ml培养基/小鼠）中，并将悬浮液转移到组织处理的细胞培养瓶（T75）中。
16. 在37℃，5％CO 2培养细胞
第5天（P2）
1. 将细胞悬液转移到50ml管（避免服用贴壁细胞！）。通过离心（300×g，10分钟，4℃）沉淀细胞，弃去上清液。通过轻轻管松开细胞和重悬细胞在20ml新鲜培养基中，并将细胞悬浮液转移到新的组织处理的细胞培养瓶（T75）。
第8天（P3）
1. 重复与第5天相同的步骤。
第12天（P4）
1. 将细胞悬液转移到新的大组织处理的细胞培养瓶（T175），（避免接管贴壁细胞！），并加入20ml新鲜培养基。
第15天（P5），第22天（P7），第29天（P9）
1. 与第5天相同的程序，但使用大（T175）培养瓶。
第19天（P6），第26天（P8）
1. 转移20ml细胞悬浮液到50ml管中。通过离心（300×g，10分钟，4℃）沉淀细胞。弃去上清液。通过轻弹管松开细胞团，将细胞重悬于20ml新鲜培养基中，并将细胞悬浮液转移回细胞培养瓶。
2. 当细胞为4周龄（P9）计数细胞并通过Kimura染色或FACS分析确定肥大细胞的纯度。如果细胞> 95％纯，它们可用于实验（图1）。如果纯度较低，则必须再培养一周。
  注意：不要超过2.5 x 10 ⁶ 的单元格密度。
  
  图1.培养4周后，骨髓来源的培养的肥大细胞的纯度超过95％。将来自C57BL/6小鼠的骨髓细胞在IMDM（含10％FCS）中培养4周，，100U/ml青霉素/链霉素和50μM2-巯基乙醇）中，在30％WEHI-3条件培养基的存在下。每次传代测定细胞数（A）和纯度（B），每周两次，用台盼蓝染色和Kimura染色。数据表示为9次独立实验的平均值±SD

食谱

完成IMDM
IMDM（500ml）
10％FCS（50ml/450ml IMDM） 5ml青霉素（100U/ml）/链霉素（100μg/ml） 1 M 2-巯基乙醇（对于50μM终浓度，加入25μl至500ml）
生长因子（在使用前加入IMDM）
30％WEHI-3条件培养基
木村染料
甲苯胺蓝溶液（50ml）（0.5mg/ml甲苯胺蓝，18g/l NaCl和22％乙醇）
饱和皂苷（2.27ml）（4mg/ml皂甙在乙醇中）
NaH 2 PO 4溶液（22.7ml）（60mM）中。

致谢

这里描述的方案改编自Sur等人（2007）和Vukman等人（2012）。

参考文献

Hochdorfer，T.，Kuhny，M.，Zorn，C.N.，Hendriks，R.W.，Vanhaesebroeck，B.，Bohnacker，T.，Krystal，G.and Huber， PI3K通路的激活增加TLR诱导的TNF-α和IL-6，但减少IL-1beta生产在肥大细胞中。细胞信号 23（5）：866-875。
Matsushima，H.，Yamada，N.，Matsue，H。和Shimada，S。（2004）。 TLR3-， TLR7-和TLR9介导的促炎细胞因子的产生来自鼠结缔组织型皮肤来源的肥大细胞的趋化因子但不是来自骨髓来源的肥大细胞。 J Immunol 173（1）：531-541。
McCurdy，J.D.，Lin，T.J.and Marshall，J.S。（2001）。 Toll样受体4介导的鼠肥大细胞活化。 Leukoc Biol 70（6）：977-984。
Mrabet-Dahbi，S.，Metz，M.，Dudeck，A.，Zuberbier，T.and Maurer，M。（2009）。鼠肥大细胞分泌一个独特的细胞因子和前列腺素响应不同的TLR2配体配置文件。 Exp Dermatol 18（5）：437-444。
Supajatura，V.，Ushio，H.，Nakao，A.，Okumura，K.，Ra，C.and Ogawa，H。（2001）。肥大细胞对肠道细菌感染的保护作用由Toll样受体4介导。 Immunol 167（4）：2250-2256。
Sur，R.，Cavender，D.and Malaviya，R。（2007）。研究肥大细胞功能的不同方法 Int Immunopharmacol 7（5）：555-567
Vukman，K.V.，Adams，P.N.，Metz，M.，Maurer，M。和O'Neill，S.M。（2013）。 Fasciola hepatica tegumental coat损害肥大细胞驱动Th1免疫应答的能力。 J Immunol 190（6）：2873-2879。
Vukman，K.V.，Metz，M.，Maurer，M。和O'Neill，S.M。（2014）。腹膜细胞衍生的肥大细胞的分离和培养生物协议 4（4）：e1052。
Vukman，K.V.，Visnovitz，T.，Adams，P.N.，Metz，M.，Maurer，M。和O'Neill，S.M。（2012）。从IL-3处理的小鼠培养的肥大细胞显示对细菌抗原刺激的受损反应。 Inflamm Res 61（1）：79-85。