材料和试剂

恶性疟原虫裂殖体
DetectX Direct cGMP或cAMP免疫测定试剂盒（Arbor Assays，目录号：K020-H1或K019-H1）
无蛋白的RPMI 1640（Life Technologies，Invitrogen ^TM）
Albumax
Zaprinast（Sigma-Aldrich，目录号：Z0878）
注意：用DMSO制成50mM储备溶液，-20℃保存。
PKG抑制剂化合物1 {4- [2-（4-氟苯基）-5-（1-甲基哌啶-4-基）-1H-吡咯-3-基]吡啶}（Merck KGaA）
注意：制成10mM的DMSO储备溶液，储存于-20℃。
抗AMA1单克隆抗体（克隆4G2dc1）（Kocken等人，1998）
完全RPMI 1640培养基（Blackman，1994）
吐温20
兔多克隆抗AMA1血清（Collins等人，2009）
磷酸酶结合的山羊抗兔IgG（全分子）（Sigma-Aldrich，目录号：A3687）
磷酸酶底物（Sigma-Aldrich，目录号：S0942）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
叠氮化钠[10％（w/v）储备水溶液]
干冰 - 乙醇混合物冻结
明胶 - 吐温储备液（封闭缓冲液）（见配方）
0.1 M碳酸钠/碳酸氢钠（pH 9.6）（见配方）
二乙醇胺缓冲液（pH 9.8）（见配方）

设备

离心机
96孔Immulon平板（Nunc ）
ELISA读数器
孵化器

程序

疟原虫中cGMP水平的测定
1. 对于细胞内环核苷酸水平的测量，将富含Percoll的裂殖体以5％血细胞比容在37℃下在充气，无蛋白的RPMI 1640中悬浮。使用标准程序培养寄生虫并富集裂殖体（Blackman，1994; Yeoh等人，2007）。将悬浮液分成各含有2×10 8个裂殖体（2×10 8个裂殖体对应于〜20μl填充细胞）的等分试样。
2. 通过离心（1分钟，13,000×g）使重复的零时间样品（每个含有2×10 8个裂殖体）沉淀并在干冰 - 乙醇混合物中快速冷冻。
3. 然后在加入75μM托普司特，托普司特加2.5μMPKG抑制剂化合物1或仅媒介物（DMSO）后，在不同的时间间隔取另外的重复样品，类似地处理。扎普司特是寄生虫磷酸二酯酶（其降解cGMP和cAMP）的抑制剂，因此导致cGMP水平增加，诱导出体。
4. 将所有样品储存在-70℃直至需要测定。
5. 使用DetectX Direct cGMP或cAMP免疫测定试剂盒，准确地按照制造商的指导测量裂殖体提取物中的cGMP和cAMP水平。
捕获ELISA用于定量分析P。恶性疟原虫血液阶段出口
1. 用100μl/孔的在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（pH9.6）中以2.5μg/ml制备的纯化单克隆抗体4G2dc1的储备液涂覆96孔Immulon平板。
2. 密封板并在4℃的潮湿气氛中孵育过夜。这和所有后续的孵化在静止时进行
3. 用PBS 0.5％（v/v）Tween 20（PBS/T）洗涤板一次，然后通过加入250μl/孔的1:4稀释的明胶 - 吐温储备溶液阻断，并在室温下孵育2小时。
4. 在单独的96孔板中制备测试培养上清液样品的系列2倍稀释液。将样品稀释到含有0.5％Albumax的RPMI 1640培养基中。对于阴性对照孔，仅使用RPMI Albumax培养基。向洗涤的ELISA板中加入样品，然后密封并在室温下孵育板1小时
5. 在PBS/T中洗涤板3x。
6. 组成在PBS/T中1:1000稀释的兔多克隆抗AMA1血清的溶液。加入100μl/孔，然后密封，并将板在室温下再孵育1小时
7. 用PBS洗涤板3x。
  注意：此阶段不使用Tween，因为它会干扰测定下一步中的碱性磷酸酶活性。
8. 加入在PBS中1:30,000稀释的100μl/孔磷酸酶缀合的山羊抗兔IgG（完整分子）。密封板，然后在室温下孵育1小时
9. 用PBS（无吐温）洗涤板5x，然后加入50μl/孔底物（1片磷酸酶底物，在5ml二乙醇胺缓冲液中）。在黑暗中37℃孵育至少30分钟。使用ELISA读数器测定OD 405。
10. 使用数据产生各种培养上清液中抗原水平的滴定曲线

食谱

明胶 - 吐温储备溶液（封闭缓冲液）
5克明胶
2.5ml Tween-20 150μl10％（w/v）叠氮化钠
500 ml PBS
在37℃温热以溶解明胶
以1:4稀释在PBS中使用
储存在4°C
可能需要加热，然后晾出瓶子
0.1M碳酸钠/碳酸氢钠（pH9.6）首先组成两个组件缓冲区
这些是
7.155g Na 2 CO 3 sub 3+ sup 10H 2 O由250ml水组成
2.1g NaHCO 3水溶液加至250ml水
混合上述缓冲液，得到pH为9.6的缓冲液作为一个近似的测量，这需要约37ml 0.1M Na 2 CO 3 SO 3。加10 3 H 2 O加73 ml 0.1M NaHCO 3/v/v
二乙醇胺缓冲液（pH 9.8）
48.5ml二乙醇胺
982μl1 M MgCl 2
2.5ml 10％（w/v）叠氮化钠加入400ml水，然后用1M HCl调节pH至9.8，然后用水补足至总共500ml 储存在4℃的黑暗中

致谢

该方法根据Collins等人（2013）中描述的原始方法改编。作者感谢Alan Thomas（生物医学灵长类研究中心，荷兰，Rijswijk）的单克隆抗体4G2dc1的礼物。这项工作得到英国医学研究委员会（U117532063）的支持，并在授予协议N°242095（EviMalAR）下获得欧洲共同体第七框架计划（FP7/2007-2013）的资助。

参考文献

Blackman，M.J。（1994）。纯化恶性疟原虫子突孢子用于分析裂殖子表面蛋白的加工-1。 Methods Cell Biol 45：213-220。
Collins，C.R.，Withers-Martinez，C.，Hackett，F。和Blackman，M.J。（2009）。抑制性抗体阻断疟疾侵袭机制组件之间的相互作用。 Pathog 5（1）：e1000273。
Collins，C.R.，Hackett，F.，Strath，M.，Penzo，M.，Withers-Martinez，C.，Baker，D.A。和Blackman，M.J。（2013）。疟疾寄生虫cGMP依赖性蛋白激酶调节血液阶段裂殖子分泌细胞器释放和排出。 PLoS Pathog 9（5）：e1003344。
Kocken，CH，van der Wel，AM，Dubbeld，MA，Narum，DL，van de Rijke，FM，van Gemert，GJ，van der Linde，X.，Bannister，LH，Janse，C.，Waters，，AW（1998）。在恶性疟原虫衍生的转基因中表达的精确时间>伯氏疟原虫是随后亚细胞定位的关键决定因素。 273（24）：15119-15124。
Yeverh，S.，O'Donnell，RA，Koussis，K.，Dluzewski，AR，Ansell，KH，Osborne，SA，Hackett，F.，Withers-Martinez，C.，Mitchell，GH，Bannister，LH，Bryans， JS，Kettleborough，CA和Blackman，MJ（2007）。丝氨酸蛋白酶的亚细胞放电介导从宿主红细胞释放入侵性疟疾寄生虫。 em> Cell 131（6）：1072-1083。