材料和试剂

小鼠胰腺
乙醇（100％，95％，85％，70％，50％）
0.85％NaCl
ddH sub 2 O
99.5％二甲苯（Sigma-Aldrich，目录号：534056）
10％福尔马林溶液（中性缓冲液）（Sigma-Aldrich，目录号：HT501128）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
Triton-X 100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
豚鼠抗胰岛素抗体（Millipore，目录号：4011-01F）
兔抗胰高血糖素抗体（Millipore，目录号：4030-01F）
小鼠抗EGFP抗体（Clonetech，目录号：632381）
德克萨斯红缀合的驴抗豚鼠抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：106-075-003）
Alexa 350结合的山羊抗兔抗体（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：A-21068）
FITC缀合的山羊抗小鼠抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：715-095-166）
ProLong Gold Antifade Reagent（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：P36935）
10x PBS（Gibco ，目录号：70011-044）
阻止解决方案（参见配方）

设备

玻璃瓶
加湿室
共焦显微镜
组织盒

程序

福尔马林固定
1. 在4℃下旋转的同时，通过10ml 10％福尔马林溶液在15ml锥形管中固定过夜胰腺（〜5mm×〜5mm）。
2. 第二天，将固定的组织转移到组织盒，并将其存储在70％乙醇溶液中，直到在室温下制备石蜡块（至少1天）。
3. 制作固定组织的石蜡块。
4. 使用Microtome制作石蜡块的滑块。
滑膜切片的免疫染色
1. 脱蜡步骤
  1. 在99.5％二甲苯溶液中保持切片5分钟2次
  2. 保持切片在99.5％二甲苯溶液中10分钟2次
  3. 用新玻璃瓶将切片在100％乙醇中保持3分钟
  4. 保持切片在95％乙醇中3分钟
  5. 保持切片在85％乙醇中3分钟。
  6. 保持切片在70％乙醇中3分钟。
  7. 保持切片在50％乙醇中5分钟。
  8. 用新的玻璃罐将切片在0.85％NaCl中保持5分钟
  9. 在1x PBS中保持切片5分钟。
2. 渗透步骤
  1. 在室温（RT）下，在含有新玻璃广口瓶的0.1％Triton-X 100的PBS中孵育切片30分钟。
  2. 孵育切片5分钟，在1x PBS与新玻璃瓶3次。
3. 阻断，一级和二级抗体（Ab）结合步骤
  1. 在组织周围吸气，直到幻灯片，而不是组织，是干燥的。仔细地，用油脂窒息在组织周围。
  2. 在coplin广口瓶中用含有0.05％Tween 20的PBS中的2％BSA封闭30分钟
  3. 吸出阻断缓冲液并在含有0.05％Tween 20的PBS中的2％BSA中在4℃下在潮湿的胃室中用胰高血糖素原始Ab（1/100稀释）孵育切片过夜（o/n）。使用足够的抗体溶液（〜150微升）完全淹没的部分。
  4. 吸出一抗，并在含有0.05％Tween 20的PBS中的2％BSA中洗涤切片5分钟，在coplin广口瓶中洗涤2次。
  5. 吸出洗涤缓冲液，并在加湿室中与相应的二抗Alexa350共轭的山羊抗兔抗体（1/500稀释）孵育切片1.15小时，在室温黑暗中。在含有0.05％Tween 20的PBS中的2％BSA中稀释辅助Ab。使用足够的抗体溶液（〜150μl）完全浸没切片。
  6. 吸出第二抗体，并在含有0.05％吐温20的PBS中的2％BSA中洗涤切片5分钟，在Coplin瓶中2次。在组织周围吸气，直到幻灯片，而不是组织，是干燥的。并在具有胰岛素初级Ab（1/500稀释）的湿润室中在含有0.05％Tween 20的PBS中的2％BSA中在黑暗中在室温孵育切片1.5小时。使用足够的抗体溶液（〜150微升）完全淹没的部分。
  7. 吸出第一抗体，并在含有0.05％Tween 20的PBS中的2％BSA中在室温下在coplin瓶中黑暗中洗涤切片5分钟。
  8. 在组织周围吸气，直到幻灯片，而不是组织，是干燥的。并在加湿的室中与相应的次级德克萨斯红缀合的驴抗豚鼠Ab孵育切片在室温在黑暗中1小时。在含有0.05％Tween 20的PBS中的2％BSA中稀释辅助Ab（1/1000稀释）。使用足够的抗体溶液（〜150μl）完全浸没切片。
  9. 吸出第二抗体，并在含有0.05％Tween 20的PBS中的2％BSA中在室温下在暗处在coplin瓶中洗涤切片5分钟。在组织周围吸气，直到幻灯片，而不是组织，是干燥的。并在加湿的外倾中用EGFP一抗（1/500稀释）孵育切片，在暗处4℃下孵育1小时。在含有0.05％Tween 20的PBS中的2％BSA中稀释的原代Ab。使用足够的抗体溶液（〜150μl）完全浸没切片。
  10. 吸出第一抗体，并在含有0.05％Tween 20的PBS中的2％BSA中在室温下在coplin瓶中黑暗中洗涤切片5分钟。
  11. 吸出洗涤缓冲液，孵育在湿润室与相应的二级FITC结合的山羊抗小鼠Ab（1/500稀释）在室温下在黑暗中1小时的切片。在含有0.05％Tween 20的PBS中的2％BSA中稀释辅助Ab。使用足够的抗体溶液（〜150μl）完全浸没切片。
  12. 吸出第二抗体，并在含有0.05％吐温20的PBS中的2％BSA中在室温下在coplin瓶中黑暗中洗涤切片5分钟。
安装步骤
1. 在组织周围抽吸，直到幻灯片，而不是组织，是干的，添加〜50微升含有DAPI的ProLong Gold Antifade Reagent到每个部分，并在截面上放置盖玻片。
  注意：小心，以避免损坏组织，滑动太多的盖玻片，不要引入气泡。吸出过量的试剂。
2. 干燥部分在室温下数小时或过夜避光。
3. 一旦幻灯片完全干燥，用清洁的指甲油密封盖玻片的边缘。载玻片可储存于-20°C，避光照射数周。

食谱

封闭溶液（含有0.05％Tween20的PBS pH7.4的2％BSA） 10 g BSA
50ml 10×PBS
0.25ml Tween20 将ddH ₂ O添加到500 ml

代表数据

图1.胰腺组织切片中EGFR，胰岛素和胰高血糖素的三重免疫染色在谭施用后3周从小鼠获得胰组织切片，以从转基因诱导EGFP。胰腺组织切片对EGFP（绿色），胰岛素（红色）和胰高血糖素（蓝色）进行三重免疫染色，并且单独显示代表性单通道荧光图像并合并（每组的右下图像）。 [请引用参考文献1（图1B）]

致谢

这项工作部分得到教育，科学和技术赠款部2011-0011433,2012M3A9C3048686和2014R1A1A4A01004329（S.H.B）资助的韩国国家研究基金会和NIH授予DK42394，HL52173和HL057346（R.J.K.）的部分支持。 R.J.K.是霍华德休斯医学研究所的研究员。该协议改编自Back等人（2009），并且适应的协议的第一简短版本在Han等人（2013）中公开。

参考文献

Back，S.H. *，Scheuner，D. *，Han，J.，Song，B.，Ribick，M.，Wang，J.，Gildersleeve，R.D.，Pennathur，S.and Kaufman，R.J。（2009）。翻译通过eIF2alpha磷酸化的衰减防止氧化应激和维持β细胞中的分化状态。细胞Metab 10（1）：13-26。 *这些作者同样对这项工作贡献了
汉族，哈佛大学学报（社会科学版），北京中医药大学学报（医学版），北京中医药大学学报，MS，Sartor，MA和Kaufman，RJ（2013）。 ER应激诱导的转录调节增加导致细胞死亡的蛋白质合成。 Nat Cell Biol 15（5）：481-490。 *这些作者同样对这项工作贡献了