材料和试剂

6叶期的烟草烟草植物</em>
注意：本田烟草可以从我们的实验室获得（图1）。

图1. 6叶期本塞>烟草植物
菌株
a。大肠杆菌菌株，例如DH5α
b。农杆菌株，例如GV3101
注意：所有菌株均来自我们的实验室。
基于pTRV1和pTRV2-LIC的表达载体（Dong等人，2007）
1. pTRV1：含有重复的CaMV 35S启动子，NOS终止子和Ppk20菌株的TRV RNA1的cDNA克隆的T-DNA载体。
2. pTRV2-LIC：一种T-DNA载体，重复的CaMV 35S启动子， NOS终止子和TRV RNA2的cDNA克隆，其中非结构基因被多克隆位点（MCS）取代。
3. pTRV2-NbPDS：在MCS中将NbPDS的基因条带插入pTRV2-LIC中。该构建体通常用作对照以显示成功的基因沉默
4. 可以在pTRV1（ABRC，目录号：CD3-1039）和pTRV2-LIC（ABRC，目录号：CD3-1042） http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/vector_3.html 。
土壤杆菌媒体
1. 液体Luria-Bertani（LB）培养基
2. 具有0.12％琼脂的固体LB平板
  注意：将LB培养基在120℃下高压灭菌20分钟。
抗生素
一个。卡那霉素
b。 Rifampicin
C。庆大霉素
Easy Taq DNA聚合酶（北京TransGen Biotech）
dNTP（Roche）
TIANprep微量质粒试剂盒（北京TransGen Biotech）
MgCl 2（Sigma-Aldrich）
MES（AMRESCO）
乙酰丁香酮（Sigma-Aldrich）
DMSO（AMRESCO）
渗透缓冲液（参见配方）

设备

离心管
植物生长室（24℃，16小时光周期条件，50％亮度）
无针1毫升无针注射器
无菌细菌培养管
离心机
PCR仪
37℃和28℃振荡孵育器

程序

如先前所述将克隆植物靶基因片段克隆到pTRV2-LIC中（Liu等人，2002），并将其转化入大肠杆菌DH5α。挑取阳性克隆，并使用特异性引物对通过PCR扩增质粒DNA，然后通过DNA测序确认正确插入。在37℃培养箱中以200rpm摇动过夜，在5ml LB液体培养基（含有50μg/ml卡那霉素）中培养阳性克隆。在室温下通过14,000×g离心1分钟收集细菌，然后使用小型质粒试剂盒提取质粒。
将pTRV1，pTRV2或其衍生物分别转化到土壤杆菌属菌株GV3101中。转化的土壤杆菌在含有50μg/ml卡那霉素，30μg/ml利福平和50μg/ml庆大霉素的LB平板上生长2天。
挑选几个克隆，并使用特异性引物通过PCR确认所生长的 grobacteria 包含正确的质粒。
从含有pTRV1，pTRV2或pTRV2衍生物的每个转化体在28℃培养箱中以200rpm振荡，在5ml液体LB培养基（含有50μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平和50μg/ml庆大霉素）中生长一个阳性克隆过夜。
注意：将农杆菌接种到用于培养的培养基中应该在超净台上进行，所使用的所有设备都需要是无菌的。
从培养箱中取出培养管。将所有土壤杆菌培养物调整到OD <600> = 1.0。用pTRV1和pTRV2或pTRV2衍生物取等体积的农杆菌培养物（OD 600 = 1.0）。将它们混合在一起并通过在室温下以3000xg离心5分钟沉淀。
倒出上清液，将农杆菌沉淀重悬在与土壤杆菌培养物相等体积的浸润缓冲液中（以使OD 600保持在约1.0）。将重悬培养物在室温下保持2-4小时
选择6叶期植物，并使用1ml注射器（无针）使再悬浮的土壤杆菌培养物膨胀到扩展的叶的背侧。每株植物需要注入2或3片叶子。植物在具有16-h/8-h光周期的生长室中在24℃的光强度为10,000勒克斯下生长。图2显示了渗透的示意图。图3显示了正确接种的叶状态注意：用于接种的每片叶常常注射2个直径为1cm的圆。

图2.渗透示意图

图3.右图显示接种后的状态，左图显示未感染的叶
接种后2周，靶基因将在整株植物水平上沉默。新叶总是表现出强烈的沉默表型，适合后续研究。图4显示PDS基因被VIGS沉默的植物的上叶

图4.成功沉默Nb 。接种后2周拍摄照片。

食谱

浸润缓冲液（10mM MgCl 2，10mM MES和200μM乙酰丁香酮）（100ml）
1M MgCl 2：20.33g MgCl 2溶解在100ml dH 2 O中，通过120℃高压灭菌20分钟。将1M MgCl 2储备液在4℃下储存 1M MES：21.325g溶解在100ml dH 2 O中的MES，用0.22μm滤膜过滤灭菌
200mM乙酰丁香酮：0.3924g乙酰丁香酮溶于10ml DMSO中。将1M MES原液在室温下储存。将200mM乙酰丁香酮贮存在-20℃ 100 ml浸润缓冲液
1ml 1M MgCl 2溶液 1 ml 1 M MES
100μl200mM乙酰丁香酮
将dH <2> O添加到100 ml

致谢

该方案改编自研究文章：Wang等人（2013）。

参考文献

Dong，Y.，Burch-Smith，T.M.，Liu，Y.，Mamillapalli，P.and Dinesh-Kumar，S.P。（2007）。用于高通量病毒诱导基因沉默的不依赖连接的克隆烟草rattle病毒载体识别NbMADS4-1和-2在花发育中。植物生理学145（4）：1161-1170。
Liu，Y.，Schiff，M.，Marathe，R。和Dinesh-Kumar，S.P。（2002）。烟草Rar1，EDS1和NPR1/NIM1样基因是N介导的烟草花叶病毒抗性所必需的。 Plant J 30（4）：415-429。
Wang，Y.，Yu，B.，Zhao，J.，Guo，J.，Li，Y.，Han，S.，Huang，L.，Du，Y.，Hong，Y.，Tang， Liu，Y。（2013）。自噬导致叶淀粉降解。植物细胞 25（4）：1383-1399。