材料和试剂

重组产生的感兴趣底物
对于该研究，将全长鼠Oct4克隆到含有T3启动子序列和羧基末端6X His-TEV-3X FLAG表位的哺乳动物表达载体中。
TnT偶联网状细胞溶解物系统（Promega Corporation，目录号：L5010）
含有感兴趣的蛋白质（测试底物）野生型，推定的突变体，空载体对照的表达载体（具有Sp6，T3或T7启动子序列）。如果不能用作激酶测定的对照，则还需要含有先前确认（和公布的）靶底物的载体。
Transcend tRNA（Promega Corporation，目录号：L5061）
RNaseOUT（Life Technologies，目录号：10777019）
对感兴趣的激酶显示活性的细胞系
SDS聚丙烯酰胺凝胶
聚二氟乙烯膜（PVDF）（Bio-Rad Laboratories，目录号：162-0177）
用于测试和控制底物的初级抗体
1. Akt（总计）（Cell Signaling Technology，目录号：4685）
2. Phospho-Akt底物抗体（Cell Signaling Technology，目录号：10001）
3. Gsk3（总计）（Cell Signaling Technology，目录号：5676）
激酶激动剂（如果需要）以增强激酶活性
该方案使用Ro-31-8220（Sigma-Aldrich，目录号：R136-5MG）作为Akt激动剂
非放射性Akt激酶测定试剂盒（Cell Signaling Technology，目录号：9840）
1. 固定化磷酸-Akt（Ser473）（D9E）兔mAb（珠缀合物）
2. 磷酸-GSK-3（Ser21/9）（37F11）兔mAb
3. GSK-3融合蛋白，浓度为0.5mg/ml
4. 10mM ATP（50μl）
珠连接的一抗或一抗和蛋白A/G琼脂糖（Pierce抗体）
苯基甲磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich）
1x细胞裂解缓冲液（参见配方）
1×激酶缓冲液（参见配方）
3x SDS样品缓冲液（参见配方）

设备

Mini-Western/Transfer Apparatus（Bio-Rad Laboratories）
10厘米板
细胞刮刀
1.5 ml微量离心管
冷冻微离心器
微量离心管旋转器
加热块设置为30和95℃

程序

体外转录/翻译

使用TnT耦合网织红细胞裂解物系统制备重组产生的感兴趣的底物。将需要野生型，激酶突变体和空载体对照

按照制造商推荐的方案进行，为每个样品设置以下反应混合物。所有试剂应保存在冰上，直到步骤C3

组件	体积（μl）
TnT裂解液	25
TnT反应缓冲液	2
T3 RNA聚合酶*	1
氨基酸-met	0.5
氨基酸 - 亮氨酸	0.5
RNaseOUT	1
Transcend tRNA	1
H sub 2 O	14
DNA（0.2μg/μl，总计1μg）	5

该试剂盒需要将目的蛋白克隆到含有SP6，T3或T7启动子序列的表达载体中。必须根据所使用的载体选择合适的聚合酶。

在30℃下孵育步骤A2中组装的反应90分钟
偶联转录/翻译的典型产率为50-500ng /μl
通过蛋白质印迹分析产物。将5μl的反应与20μl的1x SDS上样缓冲液混合。在95℃变性3分钟，并加载10μl到SDS聚丙烯酰胺凝胶上。转移凝胶到PVDF膜。使用针对所选载体中包含的目的蛋白质和/或表位标签产生的一抗来检测以确认表达
将剩余的体外转录/翻译反应储存在-20℃下，直到在步骤D中进一步使用

细胞裂解液制备
1. 文化积极生长10T1/2成纤维细胞至75％汇合。四个10cm板将足以用于对照，野生型和推定的Akt突变体底物的测定
2. 在10μMRo-31-8220的存在下在37℃下培养细胞1小时以增加Akt活化。
3. 吸出培养基，并用冰冷的PBS快速冲洗细胞两次，每次洗涤之间抽吸
4. 用完全1x细胞裂解缓冲液补充1mM PMSF裂解细胞。使用0.5毫升每10厘米板。在冰上孵育5分钟。
5. 用细胞刮刀从板上取下细胞。将裂解物置于1.5ml微量离心管中冰上30分钟，在10和20分钟，轻轻涡旋两次（设置6）10秒。不需要声处理。
6. 在4℃下以10,000×g离心裂解物10分钟。转移上清液到一个新鲜的管。将裂解物储存在-80℃直至使用
免疫沉淀
1. 每个实验将需要八次免疫沉淀;四个细胞裂解物和四个模拟免疫沉淀与1x细胞裂解缓冲液。对于每组四种免疫沉淀，使用先前证实的（在文献中）底物，一个是激酶活性的阳性对照。剩余的三个将用于重组产生的测试底物（野生型，推定的激酶突变体和空载体）。模拟免疫沉淀是用于确保激酶活性从细胞裂解物中发出的阴性对照，而不是在该方案期间使用的其它试剂。
2. 加入20微升的固定化抗体珠浆液到200微升裂解液（或1x细胞裂解缓冲液）在1.5毫升微量离心管。在4℃下，在末端旋转下孵育过夜。进行到步骤C6。固定的磷酸-Akt（Ser473）包括在非放射性Akt-激酶测定试剂盒中。
3. 或者，向200μl裂解物中加入一抗。确切的量可能需要滴定。大约1μg的亲和纯化的抗体通常就足够了
4. 在4℃下孵育过夜，并进行端到端旋转
5. 加入准备好的蛋白A/G琼脂糖珠（25μl的50％浆液）。在4℃下孵育2小时，结束 - 旋转。
6. 在4℃下以10,000×g离心免疫沉淀30秒。吸出上清液，用500μl1x细胞裂解缓冲液洗涤沉淀（在冰上）两次，每次3分钟。
7. 用500μl1x激酶缓冲液洗涤沉淀（在冰上）两次，每次3分钟
在珠上非放射性的体外激酶测定
1. 重悬在50μl的1×激酶缓冲液中的最终沉淀。
2. 加入1μl10 mM ATP（来自非放射性Akt激酶测定试剂盒）和1或2μl步骤A6中产生的激酶底物。
3. 在30℃下孵育30分钟。
4. 终止反应，加入25μl3×SDS样品缓冲液。轻轻涡旋，然后以10,000×g 微量离心收集
5. 存储在-80°C或直接进行西方分析
西方分析
1. 将每个所需样品在95℃加热3分钟。
  1. 适当控制的实验应包括西方显示：
    1. 在不存在和存在激动剂的情况下激酶（总和活化形式），以确认激酶是活性的
    2. 使用先前确认的激酶底物的对照IP-激酶测定。对于模拟和激酶暴露的样品的重复Western应该与针对蛋白质的总的和磷酸化形式的抗体一起孵育。
    3. 测试IP-激酶测定显示模拟和激酶暴露的样品的感兴趣底物的空载体，野生型和推定的激酶突变体形式。重复的西方应该如上运行。如果针对目标蛋白质的磷酸化形式的抗体不是商业上可获得的，则磷酸激酶底物抗体可以用于其位置，因为它将仅在它们被磷酸化时检测底物。
解释
1. 当以下情况时确认假定的底物：
  1. 在步骤E1a.i中确认激酶活性
  2. 在步骤E1a.ii激酶暴露的样品中，但不在模拟暴露的样品中，确认对照底物的磷酸化。
  3. 在野生型中证实推定底物的磷酸化，但不是蛋白质的推定的激酶突变体形式。对于空载体对照，不应观察到总蛋白或磷酸蛋白的表达

食谱

1x细胞裂解缓冲液
25mM Tris（pH7.5） 150mM NaCl 1mM EDTA
1 mM EGTA
1％Triton
2.5mM Na 4 P 2 O 7 sub 1 mMβ-磷酸甘油 1mM Na 3 VO 4 sub。
1μg/μl亮肽素在4°C下储存1-2周只有
1×激酶缓冲液
25mM Tris（pH7.5） 5 mMβ-磷酸甘油 2mM DTT
0.1mM Na 3+ VO 4
10mM MgCl 2/
储存于-20°C
可能在4°C储存1-2周仅有
3x SDS样品缓冲液
187.5mM Tris（pH6.8） 6％w/v SDS
30％甘油 150 mM DTT
0.03％w/v溴酚蓝
等分并储存在-20°C
在每次使用前添加DTT

致谢

这项工作得到了来自加拿大基因组，安大略基因组研究所，干细胞网络和加拿大健康研究所的资助。

参考文献

Campbell，P.A。和Rudnicki，M.A。（2013）。 Oct4与Hmgb2的相互作用调节Akt信号转导和多能性。干细胞 31（6）：1107-1120。