材料和试剂

成年老鼠大脑
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
蔗糖
氯化镁，6-水合物（MgCl 2·6H 2 O·6H 2 O）（Mallinckrodt Baker，目录号：2444-01）
脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：D6750）
NP-40（Sigma-Aldrich，目录号：I3021）
铁氰化钾（ACROS ORGANICS，目录号：196785000）
氰亚铁酸钾（Mallinckrodt Baker，目录号：6932-04）
Permount（Fisher Scientific，目录号：SP15-100）
O.C.T. compund（Sakura，目录号：4583）
乙醇（Decon Labs，目录号：2716）
X-gal（American Bioanatycal，目录号：AB00450-00005）
1 M MgCl <2> （参见配方）
10％脱氧胆酸钠（参见配方）
20％NP-40（见配方）
50 mM铁氰化钾（见配方）
50 mM亚铁氰化钾（见配方）
染色缓冲液（见配方）

设备

Cryomold（Sakura，目录号：4557）
冷冻切片机
37℃孵育器
10-20带盖的幻灯片污渍盘（VWR International，目录号：900203）或等同物

程序

小鼠用PBS灌注5分钟，然后用4％PFA/PBS再灌注5分钟
解剖出小鼠脑，并在4℃下用4％PFA/PBS后固定4小时
固定的脑用PBS洗涤三次，然后用20％蔗糖孵育过夜（或直到样品下沉），然后用30％蔗糖过夜。
将大脑安装在具有O.C.T的标准低温模型上。化合物并储存在-80℃直至使用
40微米的截面是使用低温恒温器并安装在载玻片上
载玻片用染色缓冲液（通常为150ml的容器）在室温下洗涤10分钟
然后将载玻片在补充有5mM铁氰化钾和5mM氰亚铁酸钾的染色缓冲液中在37℃下与1mg/ml X-gal一起孵育，直到颜色发展。
注意：
1. 此步骤通常需要3小时至隔夜。
2. 不要让样品变干。
3. 每张幻灯片使用100-200μlX-gal溶液。
用PBS洗涤染色的样品三次（每次5分钟）
载玻片用一系列乙醇（50％，75％，90％，100％，每次2分钟）脱水
载玻片安装在固定架上，可在室温下储存。
样品准备好以更高的放大倍数成像（图1）

图1.Nlk 基因捕获小鼠脑的X-gal染色。在Nlk 基因捕获小鼠中观察到强的β-半乳糖苷酶表达来自6周龄的Nlk 基因捕获小鼠小脑的Purkinje细胞层。 MCL，分子细胞层。 PCL，浦肯野细胞层。 GCL，颗粒细胞层。

笔记

孵育的持续时间取决于β-半乳糖苷酶的表达有多强。有时它需要超过2天的孵化。您可以在过夜孵育后使用新鲜的X-gal溶液
湿织物必须放在染色容器中。

食谱

1 M MgCl 2
将10.17g MgCl 2加入到40ml dH 2 O中。
将dH <2> O添加到50ml
在室温下贮存
10％脱氧胆酸钠将5g脱氧胆酸钠加入到40ml dH 2 O中将dH <2> O添加到50ml
在室温下贮存
20％NP-40
将10ml NP-40与40ml dH 2 O混合在室温下贮存
50 mM铁氰化钾
将16.46g铁氰化钾加入到800ml dH 2 O中将dH <2> O添加至1,000 ml
储存在4°C
避光
50 mM氰亚铁酸钾
将21.12g铁氰化钾加入到800ml dH 2 O中将dH <2> O添加至1,000 ml
储存在4°C
避光
染色缓冲区
将2ml 1M MgCl 2，1ml 10％脱氢胆酸钠，1ml 20％NP-40与800ml dH 2 O混合。将dH <2> O添加至1,000 ml
在室温下贮存

致谢

作者要感谢林实验室的成员对这份手稿的反馈。该协议改编自以前发表的论文：Ju em et al。（2013）。这项工作得到国家神经疾病和中风研究所NS064146，大脑和行为研究基金会（原NARSAD），阿尔弗雷德·斯隆基金会，国家多发性硬化症协会，查尔斯·Hood基金会，国家共济失调基金会和耶鲁学者奖计划。

参考文献

Ju，H.，Kokubu，H.，Todd，T.W.，Kahle，J.J.，Kim，S.，Richman，R.，Chirala，K.，Orr，H.T.，Zoghbi，H.Y.and Lim，多谷氨酰胺疾病的毒性是由1型脊髓小脑性共济失调中的Nemo样激酶调节的。 em> J Neurosci 33（22）：9328-9336。