材料和试剂

agr - 主动 aureus 菌株
Bacto ^TM胰蛋白酶大豆肉汤（BD，目录号：211825）
溶葡萄球菌素（Wako Chemicals USA，目录号：120-04313）
15％十二烷基硫酸钠（SDS） - 聚丙烯酰胺凝胶
N-环己基-3-氨基丙磺酸（CAPS）（Dojindo Molecular Technologies，目录号：343-08321）
甲醇
Immobilon-P（EMD Millipore，目录号：IPVH304F0）
三（羟甲基）氨基甲烷（Nacalai Tesque，目录号：35434-34）
EDTA 2Na（Dojindo Molecular Technologies，目录号：345-01865）
盐酸
Coomassie Plus Protein Assay Reagent（Thermo Fisher Scientific，目录号：23236）
Easy Blocker（GeneTex，目录号：GTX425858）
在我们的实验室中制备的抗AgrA IgG（Kaito等人，2013）
与碱性磷酸酶缀合的抗兔IgG（Promega公司，目录号：S3731）
硝基蓝四唑/5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸盐（NBT/BCIP）（Roche Diagnostics，目录号：1681451）
PVDF膜
TE缓冲区（参见配方）
裂解缓冲液（见配方）
染色缓冲液（见配方）
10x SDS样品缓冲液（见配方）
10x TBS（请参阅配方）
TBST（参见配方）

设备

具有双阶梯微尖（3mm）（Branson，部件号：101-063-212）的超声波仪（Branson，型号：Sonifier 450）
塑料容器
离心机
电泳仪
电源
湿/罐印迹系统（Bio-Rad Laboratories）

软件

图像J（1.45s，NIH）

程序

拾取单个菌落的 S。金黄色葡萄球菌加入到5ml新鲜胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中，并在37℃下以150rpm振摇，有氧培养15小时。
接种50μl过夜培养的S。金黄色葡萄球菌注射到新鲜TSB的5ml（1:100稀释）中，并在37℃下以150rpm振荡将其有氧培养24小时或15小时。起始和结束的₆₀₀将分别为约0.06-0.1和6-10。
收集650μl S.金黄色葡萄球菌细胞培养物中，在4℃下以10,000×g离心1分钟，弃去上清液。通过剧烈涡旋重悬细胞沉淀在195微升TE缓冲液。加入5微升溶葡萄球菌素（1毫克/毫升）到细胞悬浮液，孵育重悬浮在37°C，30分钟，无需搅动。
在冰上对样品进行超声处理（Branson Sonifier 450;双阶式微尖;占空比，恒定;输出对照，1;时间，15秒），并在4℃下以10,000×g离心10分钟。
注意：此步骤对于清除与细胞壁相关的大部分蛋白A至关重要。
使用Coomassie Plus蛋白测定试剂根据制造商的方案，通过Bradford方法测量上清液中的蛋白质的量。通过加入TE缓冲液平衡不同样品的蛋白质浓度。将蛋白质样品与3x SDS样品缓冲液混合
煮沸蛋白样品5分钟，并将样品在15％十二烷基硫酸钠（SDS） - 聚丙烯酰胺凝胶中在100V下电泳3小时。
注意：有关SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的详细信息，请参阅Kaito et al。（2013）。
将凝胶浸入缓冲液（10mM CAPS，20％甲醇）中10分钟。用甲醇处理PVDF膜几秒钟，并将其浸在缓冲液（10mM CAPS，20％甲醇）中。使用湿/罐印迹系统设置凝胶，膜和缓冲液（10mM CAPS，20％甲醇），并且在4℃下将来自凝胶的蛋白质在150mA下转移至PVDF膜3小时。
在塑料容器中在室温下用10ml封闭缓冲液（含有5％易阻断剂的TBST）处理膜，温和搅拌1小时。
注意：使用Easy Blocker对于降低样品中IgG对蛋白A的反应性至关重要。
在塑料容器中在室温下用缓冲搅拌1小时，用含有1：1,000抗AgrA IgG的10ml封闭缓冲液处理膜。
注意：对于使用抗体，应通过连续滴定测定合适的浓度。
用20ml TBST洗涤3次，每次5分钟，搅拌后，在塑料容器中，在室温下，用10ml含有与碱性磷酸酶缀合的抗兔IgG的封闭缓冲液处理膜，温和搅拌1小时。
用20ml TBST洗涤3次，每次5分钟搅拌后，用染色缓冲液处理膜，不搅拌5分钟。
注意：为了通过碱性磷酸酶检测蛋白质，请参见Kaito等人（2013）中的细节。
条带出现后，将膜浸在补充有10mM EDTA的TE缓冲液中以停止过染，然后在纸巾上干燥膜。
通过光密度测量扫描（Image J 1.45s，NIH）测量条带强度。

食谱

TE缓冲区
10mM Tris-HCl（pH8.0） 1mM EDTA（pH8.0）
染色缓冲区
100mM Tris-HCl（pH9.5）
100 mM NaCl
50mM MgCl 2/v/v 2％NBT/BCIP
3x SDS样品缓冲液
1.5ml 1M Tris-HCl（pH6.8） 3ml 20％SDS
3毫升甘油
500μl1％溴酚蓝
1.8ml 2-巯基乙醇
10x TBS
24.2克Tris
87.6克NaCl 1 L milliQ
加入盐酸调节pH至7.6
TBST
125 ml 10×TBS
1,168ml milliQ
7.5ml 20％Tween20

致谢

该协议改编自原始工作（Kaito等人，2013）以提供详细的程序。这项工作是由科学研究助理赞助（23249009，24590519）。这项工作部分由奈藤基金会，促进国家生物医学创新研究所（NIBIO）的健康科学基础研究计划和基因组药物研究所支持。

参考文献

Gallagher，S.R。和Emily A.Wiley，E.M。（2008）。当前协议基本实验室技术。 John Wiley& Sons，Inc.
Kaito，C.，Saito，Y.，Ikuo，M.，Omae，Y.，Mao，H.，Nagano，G.，Fujiyuki，T.，Numata，S.，Han，X.，Obata， Hasegawa，S.，Yamaguchi，H.，Inokuchi，K.，Ito，T.，Hiramatsu，K.and Sekimizu，K。（2013）。移动遗传元件SCC mec - 编码的 psm-mec RNA抑制 agrA 的翻译并减弱MRSA毒力。 9（4）：e1003269。