材料和试剂

脾细胞悬液
1. 八 - 十二周龄Balb/c小鼠品系
2. RPMI 1640（Life Technologies，Gibco ，目录号：22400-089）
3. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）
4. 无菌红血液裂解缓冲液（ACK缓冲液）（见配方）
细胞系
1. 4T1细胞系（ATCC）
  4T1是高度转移的IV期鼠乳腺癌细胞系，其缺乏雌激素和孕酮核受体并且自发转移到肺，脑和骨。
2. RPMI 1640
3. 热灭活的胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10438-026）
4. 100x抗生素 - 抗真菌剂（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：15240062）
CD4 ⁺ Treg和天然T细胞的测定和纯化
1. 别藻蓝蛋白（APC）结合的抗CD4抗体（克隆GK1.5）（eBioscience，目录号：17-0041）
2. Alexa Fluor 488-缀合的抗-CD25抗体（克隆PC61.5）（eBioscience，目录号：53-0251）
3. 藻红蛋白（PE）缀合的抗CD62L抗体（克隆MEL-14）（eBioscience，目录号：12-0621）
4. PE缀合的抗Foxp3抗体（克隆FJK-16s）（eBioscience，目录号：12-5773）
5. Fix/Perm缓冲液（eBioscience，目录号：00-5123,00-5223）
6. 10x渗透缓冲液（eBioscience，目录号：00-8333）
7. Dynal 小鼠CD4细胞阴性分离试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：114-15D）
8. 热灭活的胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10438-026）
9. FACS缓冲区（参见配方）
10. 分选细胞收集培养基（参见配方）
体外分化Treg
1. NA/LE仓鼠抗小鼠CD3ε单克隆抗体（克隆145-2C11）（BD，目录号：553057）
2. NA/LE仓鼠抗小鼠CD28单克隆抗体（克隆37.51）（BD，目录号：553294）
3. 抗生素 - 抗真菌剂（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：15240062）
4. 补充有50μMβ-巯基乙醇和抗生素 - 抗真菌剂（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：15240062）的RPMI 1640。}
5. 重组hTGFβ1（R& D Systems，目录号：100-B）（参见Recipes）
6. 重组mIL-2（R& D Systems，目录号：402-ML）（参见Recipes）

设备

1毫升注射器（BD，目录号：309628）
无菌剪刀
P60培养皿（Greiner Bio-One GmbH，目录号：628160）
无菌70μm过滤器（BD，目录号：352350）
注射器过滤器（0.22μm）（Corning，目录号：431219）
FACSAria细胞分选机
FACSAria II（BD，目录号：642510）
气流II级BSC（ESCO Corporation）
15ml锥形管（BD，目录号：352095）
5ml聚苯乙烯圆底管（BD，目录号：352052）
二十四孔板（Greiner Bio-One GmbH，目录号：662160）
离心机5810R（Eppendorf，目录号：5811000,622）
Dynal MCP-L（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：120.21D）}
CO <2>孵化器

程序

分离CD4 + + CD62L +/+ T细胞
1. 从小鼠脾制备单细胞悬液。用填充有2ml RPMI的培养皿中的1ml注射器的柱塞对着70-μm过滤器破坏脾脏。
2. 将单细胞悬浮液在15-ml锥形管中离心8分钟，不超过300×g 。
3. 用5ml的ACK缓冲液再悬浮脾细胞，并在室温下孵育5分钟。用PBS稀释，并离心8分钟，不超过300×g 。重悬细胞沉淀在FACS缓冲液和计数细胞数。通常，每个脾产生80-100×10 6个脾细胞
4. 通过使用Dynal小鼠CD4细胞阴性分离试剂盒的阴性选择来纯化CD4 + T细胞，在制造商提供的方案中详细描述。协议产量通常为脾细胞的20-25％（ http：//tools.invitrogen .com/content/sfs/manuals/dynabeads_untouched_ms_CD4_man.pdf ）。
5. 在CD4 + T细胞分离后，通过离心（在300×g下8分钟）调整细胞浓度，并在FACS缓冲液中稀释至4×10 7个//ml，并进行CD4和CD62L染色
6. 使用每200μlCD4 + T细胞悬浮液中0.2μg的APC结合的抗CD4抗体和0.3μg的PE缀合的抗CD62L抗体。在4℃下在黑暗中孵育30分钟。
7. 用FACS缓冲液洗涤细胞，在不超过300×g离心8分钟，并用浓度为3×10 7/ml的FACS缓冲液重悬细胞沉淀。
8. 使用FACSAria细胞分选仪进行CD4 +高CD62L高级群体的选择和分选。排除使用FSC-H对比FSC-W和SSC-H对SSC-W点图的细胞双联体。 Balb/c小鼠品系的总百分比应在60-70％之间，C57B1/6小鼠品系的总百分比为50-60％。流量建议调整到1-3左右。排序精度可以设置为"yield"。预期分别为每Balb/c和C57Bl/6脾脏约10×10 6次和7×10 6次CD4T初始细胞。
9. 使用15毫升锥形管收集排序的人口与2.5毫升收集媒体。在使用之前，涡流管使得管壁将被薄层流体覆盖，从而避免细胞死亡细胞偏转到管。
10. 保持排序的人口在冰上。
来自肿瘤细胞的条件培养基
1. 该步骤可以在Treg分化方案之前的任何时间进行
2. 将选定的肿瘤细胞在50％汇合的P60皿中用2ml无血清培养基平板。在37℃下用5％CO 2孵育18小时，然后收集条件培养基。用0.22μm注射器过滤器过滤，等分成200μl样品并储存在-70℃
24孔板的抗CD3涂层
1. 从无菌PBS中的CD3ε抗体（1mg/ml）制备5μg/ml的抗CD3ε溶液并涡旋。对于24孔板使用每孔150μl
2. 在37℃在潮湿气氛中孵育至少2小时。
3. 在使用前，用PBS冲洗孔，并抽吸两次
在肿瘤细胞条件培养基存在下将天然T细胞转化为Treg
1. 对于Treg转化不可缺少的刺激是TGFβ1和IL-2。为了评估Gal-1微调Treg转化频率，有必要使用前者的极限浓度。已显示TGFβ1亚型限制在调节Treg分化方面更有效。在补充有1-2ng/mlhTGFβ1，100U/ml mIL-2的无血清RPMI中，将初始T细胞浓度调节至1×10 6/1μg/ml CD28 mAb和抗生素 - 抗真菌剂
2. 在抗CD3涂覆的24孔板中每孔加入1ml初始T细胞悬浮液
3. 加入条件培养基（CM）肿瘤细胞。建议确定对CM的剂量依赖性反应。建议稀释度从1:10到1:100。
4. 在37℃下用5％CO 2孵育4天。更多的日子只会导致细胞死亡增加。
5. 在CD4，CD25和Foxp3染色后通过流式细胞术检测Treg频率
Treg染色
1. 在4℃下在黑暗中进行CD4和CD25分子的染色30分钟。每2×10 6个细胞在100μlFACS缓冲液中使用0.03μg的APC-结合的CD4抗体和0.075μg的AlexaFluor 488-结合的CD25。
2. 洗涤细胞并在不超过300×g离心8分钟。固定和透化细胞使用固定/Perm缓冲液100微升30分钟到18小时在黑暗中4°C。
3. 用1×渗透缓冲液洗涤细胞。 Foxp3染色在100μl1×渗透缓冲液中使用0.225μgPE-缀合的Foxp3抗体在4℃在黑暗中进行1小时。
4. 用1×渗透缓冲液洗涤细胞，在300×g离心10分钟并重悬在FACS缓冲液中。
5. 对于流式细胞术分析，必须使用双激光细胞计数器，并且应考虑包含适当补偿样品的5个额外的管。强烈建议使用FSC-H对比FSC-W和SSC-H对SSC-W点图排除细胞双联体。

食谱

磷酸盐缓冲液（PBS）
136 mM NaCl 8.2mM Na 2 HPO 4
1.5mM KH 2 PO 4 4/v/v 2.7mM KCl（pH7.4）
无菌红血液裂解缓冲液（ACK缓冲液）
150mM NH 4 Cl/s 10mM KHCO 3
0.1mM EDTA
重悬于蒸馏的H 2 O中
过滤灭菌（0.45μm）
储存在4°C
FACS缓冲区
含有0.1％BSA和2mM EDTA的PBS
分选细胞收集培养基
补充有20％FBS的RPMI 1640
重组hTGFβ₁
溶于磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）至工作稀释液30μg/ml分装于-70°C保存
重组mIL-2
在PBS中溶解至10μg/ml的工作稀释液
以等分试样储存在-70℃下
注意：避免反复冻融，因为这可能导致活动丧失。

致谢

该协议基于在Dalotto-Moreno等人（2013）中发表的原始着作。这项工作得到了阿根廷国家贸易委员会（ANPCyT; PICT 2007-093到MS和2010-870到GAR和Consejo Nacional de InvestigacionesCientíficasyTécnicas（CONICET; PIP 2010-2012到MS和GAR），基金会对GAR的销售作者要特别感谢MaríaRosa Morales的动物技术帮助。

参考文献

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Dalotto-Moreno，T.，Croci，DO，Cerliani，JP，Martinez-Allo，VC，Dergan-Dylon，S.，Mendez-Huergo，SP，Stupirski，JC，Mazal，D.，Osinaga，E.，Toscano， MA，Sundblad，V.，Rabinovich，GA和Salatino，M。（2013）。靶向半乳凝素-1可以克服乳腺癌相关的免疫抑制，并预防转移性疾病。 Cancer Res 73（3）：1107-1117。
Sakaguchi，S.（2004）。天然CD4 +调节性T细胞免疫自我耐受和免疫反应的阴性控制。 Annu Rev Immunol 22：531-562
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