材料和试剂

Vero细胞（从非洲绿猴提取的肾上皮细胞）（ATCC，目录号：CCL-81 ^TM）
H1299细胞（人肺癌细胞系）（ATCC，目录号：CRL-5803 ^TM）
适应于IBV的Beaudette菌株（ATCC，目录号：VR-22）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：11960-044）
注意：它含有更多的维生素和更多的葡萄糖，以及铁，适合大多数类型的细胞。
Roswell Park Memorial Institute培养基（RPMI）1640（Life Technologies，Gibco ，目录号：21870-076）
注意：该培养基含有大量的磷酸盐，并配制用于5％二氧化碳气氛。
胰蛋白酶/EDTA（Life Technologies，Gibco ，目录号：25200-072）
TRIzol试剂（Life Technologies，Gibco ，目录号：15596-018）
氯仿（Thermo Fisher Scientific，目录号：C/4960/17）
异丙醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：P/7507/17）
乙醇（Merck KGaA，目录号：1.00983.2500）
无RNase水
逆转录酶AMV（Roche Diagnostics，目录号：10109118001）
Oligo（dT）（1 Base Biochemicals）
RNasin核糖核酸酶抑制剂（Promega Corporation，目录号：N2511）
引物（1 ^Base Base Biochemicals）
DIG标记试剂盒（Roche，目录号：11175025910）
RNA加载缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0363S）
琼脂糖（1μlBase Biochemicals，目录号：BIO-100-500G）
甲醛（Thermo Fisher Scientific，目录号：F75P1GAL））
溴化乙锭（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610433）
Hybond TM膜（Amersham Biosciences，目录号：RPN303B）
DIG洗涤和封闭缓冲液组（Roche Diagnostics，目录号：11585762001）
DIG easy Hyb（Roche Diagnostics，目录号：11603558001）
抗洋地黄毒苷-AP fab片段（Roche Diagnostics，目录号：11093274910）
CDP-星级（Roche Diagnostics，目录号：12041677001）
Amersham hyperfilm ECL（Amersham Biosciences，目录号：28906837）
70％无RNA酶的乙醇
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris碱）（Promega Corporation，目录号：H5135）
乙酸（Glacial）（Merck KGaA，目录号：1.00063.2500）
3-（4-吗啉代）丙烷磺酸（MOPS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP308-500）
乙酸钠 3H 2 O（Thermo Fisher Scientific，目录号：S207-10）
柠檬酸钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：S25545）
10x TAE电泳缓冲液（1 L）（参见配方）
10x MOPS缓冲液（1 L）（参见配方）
1x MOPS缓冲液（1 L）（参见配方）
1.3％甲醛琼脂糖凝胶（见配方）
乙酸钠 3H 2 O（Thermo Fisher Scientific，目录号：S207-10）
柠檬酸钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：S25545）
10x TAE电泳缓冲液（1 L）（参见配方）
10x MOPS缓冲液（1 L）（参见配方）
1x MOPS缓冲液（1 L）（参见配方）
1.3％甲醛琼脂糖凝胶（见配方）
Forma^TM Steri-Cycle^TM CO2 Incubators (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 201370)
OLYMPUS CKX31 microscope
Eppendorf centrifuge 5415R
NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, model: ND-1000 spectrophotometer)
Power Pac and electrophoresis tank (Bio-Rad Laboratories)
Tray
Glass plate
Tissue paper
CL-1000, ultraviolet crosslinker (UVP)
Hybaid Maxi 14 Hybridization Oven (Thermo Fisher Scientific)
Hybridization tubes
Kodak Biomax cassette (Eastman Kodak Company)
柯达X-OMAT 2000处理器（Eastman Kodak公司）

程序

RNA提取
1. 将细胞接种在直径为100mm的培养皿中，并在37℃下用2PFU的活IBV /细胞或相同量的UV灭活的IBV（UV-IBV）感染。通过在感染后1小时更换新鲜培养基除去培养基中的过量病毒。
2. 将IBV感染的细胞在37℃下在5％CO 2中孵育。
3. 在指定的时间点（感染后0,2,4,8,12,16,20,24,28h），将细胞用10ml磷酸缓冲盐水（PBS）缓冲液漂洗一次并在室温下在1ml TRIzol中裂解5分钟温度。
4. 将细胞裂解物转移到eppendorf管中，并向每个管中加入五分之一（体积/体积）的氯仿。
5. 用手剧烈摇动管15秒，并在室温下温育3分钟，然后在4℃以12,000×g离心15分钟。
6. 将上层水相转移到新管中并与1:1（体积/体积）的100％异丙醇混合，然后在室温下温育10分钟。
7. 通过在4℃以12,000×g离心10分钟沉淀RNA。
8. 用1ml 70％无RNA酶的乙醇洗涤RNA沉淀一次，并以7500×g离心5分钟。
9. 将RNA沉淀物空气干燥并通过在65℃下孵育15分钟溶于100μl无RNA酶的H 2 O中。
10. RNA浓度和纯度通过NanoDrop测定。
11. 将RNA储存在-80℃用于进一步使用。
探针制备
1. 通过RT-PCR获得Northern印迹探针，并使用DIG标记试剂盒通过地高辛（DIG）标记，如下所述。
2. 在最终体积为10.5μl的无菌0.2ml薄壁Gene-Amp PCR管中，将2μg总RNA加入2μl10pmol寡核苷酸（dT）中。
3. 在65℃变性10分钟后，立即在冰上冷却试管。
4. 然后将变性的RNA-引物混合物加入到最终体积为20μl的反应混合物中，该反应混合物含有10mM dNTP，20单位的Rnasinα核糖核酸酶抑制剂，1x Expand反转录酶缓冲液和50单位逆转录酶。
5. 第一链cDNA在43℃合成1小时，反应可以通过在65℃加热10分钟终止（任选）。
6. 使用DIG标记试剂盒，根据制造商的手册，通过聚合酶链反应（PCR）在25或50μl含有合适的引物对和PFU聚合酶的反应中实现cDNA的扩增。
7. 用于人ATF4的引物是5'-CCGTCCCAAACCTTACGATC-3'（正向）和5'-ACTATCCTCAACTAGGGGAC-3'（反向）。用于人ATF3的引物是5'-GGTTAGGACTCTCCACTCAA-3（正向）和5'-AGACAGTAGCCAGCGTCCTT-3'（反向）。用于人GADD153的引物是5'-GATTCCAGTCAGAGCTCCCT3'（正向）和5'-GTAGTGTGGCCCAAGTGGGG-3'（反向）。准备每个相应PCR引物的10倍浓度溶液
8. 将以下试剂按以下顺序在冰上的0.2ml反应管中加入：ddH 2 O32.25μl，PCR缓冲液5μl，PCR DIG标记混合物5μl，正向引物5μl，反向引物5μl，酶混合物0.75μl，模板cDNA2μl，终体积50μl。涡旋混合物并短暂离心
9. 将样品置于热块循环仪中并在以下条件下进行PCR：在95℃初始变性2分钟，在95℃变性10秒，在60℃退火30秒，并在72℃延伸2分钟，重复变性，退火和延伸30个循环，最后在72℃延伸7分钟。
10. 在琼脂糖微量凝胶上运行每个PCR反应的一部分，然后用溴化乙锭染色凝胶，并在UV下检查PCR产物。
Northern印迹
1. 为了通过Northern印迹分析RNA表达，将来自每个样品制备物的30μgRNA与RNA加载缓冲液混合，并加载在1.3％琼脂糖甲醛凝胶（参见Recipes）中的孔上。
2. 运行凝胶用3-4 V/cm在无RNA酶的凝胶盒中4小时，直到RNA被充分分离。
3. 在0.25 - 0.5μg/ml溴化乙锭中简单染色凝胶，并在紫外光下检查凝胶
4. 在20x SSC中漂洗凝胶2×15分钟，并通过用20×SSC在室温下过夜通过毛细管转移将凝胶上的RNA转移到Hybond TM超-N +膜上。
5. 通过紫外线交联将RNA固定在膜上。所使用的能量在245nm下为20,000μJoules/cm 2
6. 在UV交联之后，在ddH 2 O中短暂冲洗膜并允许空气干燥。
7. 预杂交膜用DIG easy Hyb 30分钟，轻轻搅拌68℃。
8. 通过煮沸5分钟并在冰中快速冷却来变性DIG标记的RNA探针，并将变性探针（25ng/ml）加入到10ml预热的DIG Easy Hyb中。
9. 将10ml探针/杂交混合物加入膜中，并在轻轻搅拌下在68℃温育6小时。
10. 杂交后，在25℃下在恒定搅拌下用2×SSC，0.1％SDS洗涤膜2×5分钟，然后在68℃下在恒定搅拌下用0.1×SSC，0.1％SDS洗涤2×15分钟。
11. 然后将膜在洗涤缓冲液中短暂漂洗（5分钟），并在封闭缓冲液中封闭30分钟。
12. 封闭后，将膜与DIG抗体（稀释的抗DIG-AP1：10,000在封闭缓冲液中）温育30分钟，在洗涤缓冲液中洗涤2×15分钟，并在检测缓冲液中平衡3分钟。
13. 根据制造商的说明书，使用CDP-Star检测信号（参见图1-3）。
  
  图1 。在IBV感染的细胞中ATF4 mRNA的Northern印迹分析.Vero和H1299细胞用IBV（MOI〜1）感染，并在指定的时间点收获。分离总RNA并使用ATF4探针进行Northern印迹。将28S rRNA和18S rRNA的溴化乙锭染色显示为加样对照。确定ATF4的条带强度并归一化为rRNA
  
  图2. 在IBV感染的细胞中ATF3 mRNA的Northern印迹分析。如图1所示感染Vero和H1299细胞。如图1所示进行RNA提取和Northern印迹1使用ATF3探针。
  
  图3. 在IBV感染的细胞中，mRNA水平的GADD153的Northern印迹分析。用IBV（MOI〜1）感染Vero和H1299细胞或用UV-IBV孵育并在指定的时间点收获。 RNA提取和Northern印迹如图1使用GADD153探针进行

食谱

10×TAE电泳缓冲液（1L）
48.4g三（羟甲基）氨基甲烷（Tris碱） 11.4ml 17.4M冰醋酸
3.7g EDTA，二钠盐
ddH sub 2 O
10x MOPS缓冲液（1 L）
83.7g 3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）
13.61g乙酸钠。3 H 2 O 2 3.7 g EDTA
ddH sub 2 O
1x MOPS缓冲区（1 L）
100 ml 10x MOPS缓冲液
20ml 37％甲醛
880ml ddH 2 O 2·h/v
1.3％甲醛琼脂糖凝胶 1.3克琼脂糖 10ml 10×甲醛琼脂糖凝胶缓冲液
将无RNase的水加至100 ml
加热混合物以熔化琼脂糖
在水浴中冷却至65℃。
加入1.8ml的37％（12.3M）甲醛（1当量）和1μl的10mg/ml溴化乙锭储液
充分混合并倒入凝胶支架上
在运行凝胶之前，在1x甲醛琼脂糖凝胶运行缓冲液中平衡至少30分钟
20x SSC缓冲液（1L）
175.3g NaCl
88.2g柠檬酸钠
ddH sub 2 O
用几滴14N HCl溶液调节pH至7.0 高压灭菌
灭菌
2×SSC，0.1％SDS（1L） 100ml 20x SSC缓冲液
10ml 10％SDS
890ml ddH 2 O·dm/h
0.1x SSC，0.1％SDS 10ml 20×SSC缓冲液
10ml 10％SDS
980ml ddH 2 O 2 /

致谢

该协议改编自先前的出版物Liao等人（2013）。这项工作得到国家研究基金会的竞争研究计划（CRP）资助（R-154-000-529-281）的部分支持，新加坡。

参考文献

Liao，Y.，Fung，T. S.，Huang，M.，Fang，S. G.，Zhong，Y.和Liu，D. X.（2013）。在冠状病毒感染性支气管炎病毒感染期间上调CHOP/GADD153通过限制细胞外信号传导的细胞活化来调节细胞凋亡，调节的激酶通路。 J Virol 87（14）：8124-8134。