材料和试剂

HEK293
Dulbecco改良的Eagle培养基高葡萄糖（DMEM）（Life Technologies，目录号：11965-084）
胎牛血清（FBS）（Hyclone，目录号：SH30071.03）
没有Ca 2+和Mg 2+的缓冲液（Life Technologies，目录号：14190136）
胰蛋白酶/EDTA（Life Technologies，目录号：25300054）
IgG sepharose6 fast flow（GE，目录号：17-0969-01）
M13mp18 DNA（New England Biolab，目录号：N4040S）
DNA寡核苷酸：CCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAC
DNA聚合酶I klenow片段（New England Biolab，目录号：M0210S）
100mM dCTP（Promega Corporation，产品编号：U1221）
100mM dGTP（Promega Corporation，目录号：U1211）
100mM dATP（Promega Corporation，目录号：U1201）
100mM ATP（Roche Diagnostics，目录号：11140965001）
[gamma- ³² P] dATP
DNA装载染料
聚丙烯酰胺凝胶
1 M Tris（pH 7.6）（参见配方）
0.1 M Tris（pH 7.6）（参见配方）
5 M NaCl原液（见配方）
1 M MgCl 2 原料（见配方）
10mM MgCl 2（参见配方）
0.1M PMSF（Sigma-Aldrich，目录号：78830）（参见Recipes）
0.1M DTT（Sigma-Aldrich，目录号：43819）（参见Recipes）
1mg/ml抑酶肽（Roche Diagnostics，目录号：10236624001）（参见Recipes）
1mg/ml亮抑酶肽（Roche Diagnostics，目录号：11017101001）（参见Recipes）
1mg/ml胃酶抑素A（Roche Diagnostics，目录号：10253286001）（参见Recipes）
10％NP40原料（见配方）
1％牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich）（参见Recipes）
10 mg/ml BSA（见配方）
10x TBE缓冲区（参见配方）
IPP400缓冲区（参见配方）
解旋酶测定缓冲液（参见配方）
停止缓冲区（参见配方）
丙烯酰胺凝胶（见配方）

设备

20G针（BD，目录号：305175）
PowerPac基本电源（Bio-Rad Laboratories，目录号：164-5050）
Mini-Protean四细胞（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-8000）
Sorvall RC 6 plus离心机和Sorvall SA-600转子（Thermo Fisher Scientific）
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
台风9410可变模式成像仪
存储荧光屏和暗盒（GE）
Fisher Vortex Genie 2（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-812）

程序

蛋白质纯化和固定
注意：在此程序之前，建议将离心机预冷至4˚C，并在冰上冷却本程序中使用的所有缓冲液。在寒冷的条件下执行所有步骤是最佳的。
1. 转染后48小时（推荐用于HEK293细胞转染的磷酸钙测定）在我们的实验中，在15cm培养皿中使用编码与IIT标签（IgG-IgG-TEV标签）融合的Merkel细胞多瘤病毒大T抗原的质粒或10cm培养皿），用冷PBS洗涤转染的细胞，刮擦并重悬于冷PBS中，并以500×g离心5分钟，4℃沉淀。
2. 用冷PBS洗涤细胞一次，并在500×g下再沉淀5分钟，4℃。
3. 用IPP400洗涤细胞沉淀（每个1×10 7个细胞的100μl缓冲液，比例可根据细胞系调节）对于HEK293，汇合的10cm培养皿含有1×10 7个细胞，/sup>细胞，汇合的15cm培养皿含有2.5×10 7个细胞）
4. 使细胞通过20-G针10次，并在4℃下旋转1小时
5. 在旋转期间，用至少5x树脂体积的PBS洗涤IgG Sepharose6 Fast flow珠一次。坐在冰上，直到大部分树脂沉降下来。通常需要10-20分钟。
6. 在4℃下旋转除去PBS和在1％（w/v）BSA PBS溶液中的预封闭IgG Sepharose6 Fast流动至少30分钟。在冰上放置树脂。
7. 将步骤A4中的细胞裂解物以32,572×g离心15分钟，4℃以除去碎屑。
8. 在步骤A6中从树脂中除去1％BSA，将来自步骤A7的上清液与来自步骤A6的预封闭的树脂混合。通常，在我们的实验中，使用10-15μl树脂用于来自每个15cm培养皿的细胞裂解物
9. 在4℃下旋转2小时。
10. 将树脂放在冰上，轻轻地用细尖去除上清液。加入至少5体积的补充有0.01％（v/v）的终浓度的NP-40的IPP400。重新悬挂树脂。
11. 重复步骤A10至少两次。
12. 用IPP400清洗树脂，不使用NP40，按照步骤A10进行两次。
13. 将树脂置于冰上并除去上清液。
14. 在500℃下旋转树脂5分钟，4℃。用细尖轻轻取出所有液体。
15. 平衡用10树脂体积的1x解旋酶测定缓冲液。将树脂放在冰上。在树脂上使用尽可能新鲜的固定化蛋白质。通常，每个使用10微升珠和约1微克蛋白质反应（以测量从每个培养皿获得多少重组蛋白，根据制造商的方案通过IgG树脂纯化蛋白质并简单定量纯化的蛋白质）。在每个反应中蛋白质的使用是可调节的

基材标签
注意：本程序中使用放射性材料。请按照标准指南安全处理放射性物质。

将合成的寡聚DNA溶解于灭菌水中至终浓度为35ng /μl

准备退火反应如下：

试剂	卷	最终浓度。
M13mp18单链DNA（250ng /μl）	4微升
Oligo（35 ng /μl）	1微升
0.1 MTris-Cl（pH7.6）	4.3微升	10 mM
10mM MgCl 2/	4.3微升	1 mM
向最终体积43μl中加入H O

加热至95℃15分钟
短暂旋转。在50℃孵育1小时
短暂旋转。慢慢冷却至室温。
加入5μlNEB限制性酶缓冲液2.
加入dCTP和dGTP至终浓度0.1mM和1μl[α-32 P] -dATP（3000Ci/mM，1mCi/ml）。
加入1μlDNA聚合酶I Klenow片段
在室温下孵育20分钟。
加入0.5μl10 mM dATP。在室温下再温育20分钟。
使用标记的底物尽可能新鲜。避免冻融。
滴定标记的底物如下：取1,2,3,4,5μl底物，加入灭菌水至9μl，加入1μl10x DNA加载染料。煮5-10分钟。负载在11％非变性聚丙烯酰胺凝胶和电泳。干凝胶并暴露于放射自显影。根据标记效率和存储荧光灵敏度（在我们的实验中使用10-40ng标记的DNA），在解旋酶测定中调节底物的使用。

解脂酶活性检测
注意：本程序中使用放射性材料。请按照标准指南安全处理放射性物质。
1. 按如下方法制备反应缓冲液：
  10x解旋酶测定缓冲液5μl
  100mM ATP1μl
  H sub 2 O 44-xμl
  在步骤A15中轻轻地从树脂中除去1×解旋酶缓冲液。向树脂中加入反应缓冲液。
2. 在反应中加入xμl标记的底物（取决于滴定）
3. 在37℃孵育30分钟（在此过程中，保持摇动管在Fisher涡流混合器上，速度为1.5）。
4. 加入5μl终止缓冲液
5. 短暂涡旋，在室温下短暂旋转树脂并取上清液。与10x DNA加载染料混合，并将5-10μl上清液加载到11％非变性聚丙烯酰胺凝胶上。电泳在1x TBE缓冲液中。
6. 干凝胶，并进行放射自显影

笔记

在IPP400缓冲液中加入10％甘油是有帮助的，但不是必需的
固定化蛋白在其他树脂上也可以工作，但作者没有测试其他树脂系统
冷冻和解冻标记的底物会带来意想不到的条带
如果你想使用乙烯醇沉淀，DNA纯化试剂盒等清除寡核苷酸底物上的游离标记核酸，应监测纯化底物的质量，以确保标记的短寡核苷酸不被解离来自M13mp18基因组
如果使用同种单链DNA，DNA寡核苷酸或放射性标记的脱氧核糖核苷酸（例如[α-32 P] dCTP等），则在步骤B7可调。值得注意的是，您的设计应确保您的放射性标记的脱氧核糖核苷酸已经被掺入您的底物中，然后通过脱氧核糖核苷酸缺陷停止反应（在该方案中，反应将被dTTP缺乏所阻止）。

食谱

1 M Tris（pH 7.6）储液
将121.14g Tris碱与600ml dH 2 O混合，用HCl调节pH至7.6，将总体积调整为1升
过滤灭菌（0.45μm）
储存在4°C
以相同的方式制备1M Tris（pH7.5）和1M Tris（pH8.0）。
0.1M Tris（pH 7.6）
将100μl1M Tris（pH7.6）加入900μldH 2 O 2/v 准备新鲜的
5 M NaCl储液
将292.2g氯化钠与800ml dH 2 O混合将总体积调整为1升
过滤灭菌（0.45μm）
储存在4°C
1 M MgCl 2 原料
将95.2g氯化镁与800ml dH 2 O混合将dH 2加到最终体积为1L的
中过滤灭菌（0.45μm）
储存在4°C
10mM MgCl 2/
将10μl1M MgCl 2添加到990μldH 2 O中
准备新鲜的
0.1 M PMSF
将174.2mg PMSF与10ml乙醇混合储存于-20°C
0.1 M DTT
将1.5g DTT溶解在8ml H 2 O中将总体积调整为10 ml
取100μl，与900μldH 2 O混合储存在-20˚C
1mg/ml抑肽酶
将20mg抑肽酶溶解在20ml H 2 O中储存于-20°C
1mg/ml亮肽素将20mg亮抑酶肽溶解在20ml H 2 O中储存于-20°C
1mg/ml胃酶抑素A
将20mg胃酶抑素A溶于20ml甲醇中储存于-20°C
10％NP40股票
将50ml NP40与400ml dH 2 O混合将总体积调整为500 ml
过滤灭菌（0.45μm）
储存在4°C
1％BSA
将0.1g BSA与400μldH 2 O混合将总体积调整为10 ml
过滤灭菌（0.45μm）
储存在4°C不超过1个月
10mg/ml BSA
将100mg BSA与10ml dH 2 O混合过滤灭菌（0.45μm）
储存于-20°C
10x TBE缓冲区
108克Tris
55克硼酸 7.5g EDTA，二钠盐
加入到800ml dH 2 O中，然后将总体积调节到1L

IPP400缓冲液

股票	20ml	最终浓度。
1M Tris-Cl [pH 8.0]	200μl	10 mM
5 M NaCl	1600微升	400 mM
0.1 M PMSF	40微升	0.2 mM
1mg/ml抑肽酶	20微升	1μg/ml
1mg/ml亮肽素	20微升	1μg/ml
1mg/ml胃酶抑素A	20微升	1μg/ml
ddH 2 O至20ml

解旋酶测定缓冲液

库存
10 ml
10x最终浓度。

1M Tris-Cl（pH7.5） 2 ml
200 mM

1 M MgCl 2
1 ml
100 mM

10mg/ml BSA
1 ml
1 mg/ml

H sub 2 O
6毫升

加入5μl0.1M DTT到100μl解旋酶测定缓冲液中，终浓度为5mM
停止缓冲区
3.3％SDS（w/v）和0.1M EDTA在dH 2 O中

丙烯酰胺凝胶

丙烯酰胺	丙烯酰胺（30％，29:1）（ml）	10x TBE （ml）	ddH sub 2 O （ml）	TEMED （μl）	10％AP （μl）
3.5％	0.583	0.5	3.917	2.5	25
5.0％	0.833	0.5	3.667	2.5	25
8.0％	1.333	0.5	3.167	2.5	25
11.0％	1.833	0.5	3	2.5	25
15.0％	2.50	0.5	2.0	2.5	25
20.0％	3.333	0.5	1.167	2.5	25

致谢

该协议改编自我们之前的出版物Li 等人（2012）。我们承认来自我们实验室成员的手稿的有见地的批评。这项研究得到艾滋病相关恶性肿瘤试验项目奖（国家癌症研究所），国家卫生研究院（NIH）拨款R01CA148768和R01CA142723，以及NIH，国家癌症研究所，癌症研究中心的校内研究计划的支持。

参考文献

Li，J.，Wang，X.，Diaz，J.，Tsang，S.H.，Buck，C.B.and You，J.（2013）。默克尔细胞多瘤病毒大T抗原破坏宿主基因组完整性，抑制细胞增殖。 Virol 87（16）：9173-9188。
Stahl，H.，Dröge，P。和Knippers，R。（1986）。 SV40大肿瘤抗原的DNA解旋酶活性。 EMBO J ; 5（8）：1939.
Wu，C.，Roy，R。和Simmons，D.T。（2001）。 T抗原的单链DNA结合活性在猿猴病毒40 DNA复制中的作用。/a> J Virol 75（6）：2839-2847