材料和试剂

小鼠适应的朊病毒感染的小鼠脑（在约6个月龄时脑内接种小鼠适应的瘙痒病的终末期CD-1雌性小鼠）
乙醇（99.5％EtOH）（Nacalai Tesque，目录号：14713-95）
不含Ca和Mg的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）（Nacalai Tesque，目录号：14249-95）
Hank's平衡盐溶液（HBSS）（Sigma-Aldrich，目录号：H8264）
Dulbecco改良Eagle培养基/营养F-12 Ham（DMEM/F12 Ham）（Sigma-Aldrich，目录号：D8437）
N-2补充剂（Life Technologies，目录号：17502-048）
牛血清白蛋白溶液（30％BSA的D-PBS溶液）（Sigma-Aldrich，目录号：A9576）
Accutase（Innovative Cell Technologies，目录号：AT-104）
99％丙酮（Nacalai Tesque，目录号：00310-95）
胚胎移植用水（无菌过滤）（Sigma-Aldrich，目录号：W1503）
35％盐酸（HCl）（Nacalai Tesque，目录号：18321-05）
青霉素 - 链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P0781）
表皮生长因子人（EGF）（Sigma-Aldrich，目录号：E9644）（参见Recipes）
成纤维细胞生长因子 - 碱性人（bFGF）（Sigma-Aldrich，目录号：F0291）（参见配方）
神经球基础培养基（见配方）
纤连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：F4759）（参见Recipes）
玻璃清洗溶液（见配方）
分化诱导介质（参见配方）

设备

Falcon 15ml锥形离心管（Corning，目录号：352096）
Falcon 50ml圆锥形离心管（Corning，目录号：352070）
Corning primaria 6孔透明多孔板（Corning，目录号：353846）
具有HydroCell表面的Nunc 60mm皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：174912）
玻璃盖玻片（22×22mm）（Asahi Techno Glass Corporation，目录号：2918）
ART 1000 REACH提示（Thermo Fisher Scientific，目录号：2079）
多珠冲击器细胞破碎机（Yasui Kikai Corporation）
2ml螺旋盖微量离心管 - 独立式（Sarstedt K.K.，目录号：72.664.002）
氧化锆球（直径1 mm）（As One YTZ1）
塑料方形盘（Eiken Chemical，型号：AW2000）
1.5ml螺旋盖微量离心管（Sarstedt K.K.，目录号：72.687.028J）
密封超声波仪（Biorupter ，型号：UCD250）
离心机（Kubota Corporation，型号：5220）
CO 2培养箱（设定在37℃和5％CO 2 -95％空气）下培育。
交互振荡器（Taitec，型号：NR-1）
生物安全柜（ORIENTAL GIKEN，型号：LAD-1300XB3）
深冷冻（设定在-80℃）
细钳（NAPOX A-5,110mm; NAPOX MA-45,110mm）
C-Chip一次性血细胞计数器（iN CYTO，DHC-N01 Neubauer Improved）
电平衡（Mettler Toledo，型号：AB104-S）

程序

玻璃盖玻片的制备
1. 浸入24玻璃盖玻片在含有玻璃洗涤溶液（25-30毫升）的塑料方盘，在25°C下12-16小时，使用往复振荡器以50 rpm的温和摇动（图1）。
  
  图1.在往复振动器上的塑料方形盘中的玻璃盖玻片的清洗过程
2. 将盖玻片放置在50ml锥形管中，用35ml丙酮洗涤盖玻片1分钟，每次3分钟，倒置管。
3. 在生物安全柜中，在空气干燥30秒后，将单个盖玻片短暂地通过火焰，并在6孔板的每个孔的底部放置一个盖玻片。
4. 在生物安全柜中，用1.5ml纤连蛋白溶液包被盖玻片，并在37℃孵育12-16小时。吸入纤维连接蛋白溶液后，将空气干燥的盖玻片放置在孔底部30分钟（图2）。
  
  图2.在生物安全柜中放置在6孔板中的纤维连接蛋白包被的玻璃盖玻片的空气干燥
制备朊病毒感染的脑匀浆
已知朊病毒，人和动物中的致命神经疾病的感染剂，对于灭活或消除微生物的常规物理和化学程序是高度耐受的。为了最小化生物危险风险，在处理朊病毒感染的组织之前，您必须与您部门的生物安全官员联系，并遵守生物安全法规。所需的个人防护设备，净化方法，废物管理和程序应参考每个机构的生物安全法规。例如，请参见其他地方发表的朊病毒实验指南（Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories第5版：
http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf ）。
1. 在生物安全柜中，用电平衡称重大脑，沿着中线将其切断，并将含有脑干和小脑的每个半球置于含有氧化锆球（约800mg）的2ml螺旋盖微型离心管中，如图所示在图3中
  
  图3.朊病毒感染的脑组织的解剖和加载到含有氧化锆球的螺旋微型离心管中
2. 在4℃下加入1ml无菌D-PBS，并通过多珠震动器在3000rpm下在25℃下匀化1分钟。再次重复此均质化过程。
3. 将脑匀浆放入15毫升锥形管，并加入适当体积的无菌D-PBS在4℃下调整为10％重量/体积。
4. 等分（250微升）在1.5毫升螺旋盖微量离心管，并储存在-80℃下使用。在25°C解冻后，使用密封的超声波仪在内容物超声处理30秒，然后使用

NSC培养物的制备

在室温下以200xg离心5分钟从转基因小鼠中过表达鼠朊病毒蛋白（tga20小鼠）的神经球悬浮液（约100-150μm直径）离心5分钟（Iwamaru等， em>，2013; Iwamaru ，，2014）。弃去上清液，重悬于2ml Accutase中，并在37℃下孵育10分钟。
轻轻地吸取上下使用ART 1000到达提示将神经球分离成单个细胞。加入12毫升HBSS，并通过使用C-Chip一次性计数细胞悬液（10微升）的细胞密度血细胞计数器。在25℃下以200×g离心5分钟，弃去上清液。在神经球基础培养基中以100,000个细胞/ml的浓度重悬沉淀。将2ml细胞悬浮液分配到含有在步骤A4中制备的玻璃盖玻片的6孔板的孔中。
在37℃在CO 2培养箱中孵育两天后，向培养物中加入1ml Neurosphere基础培养基。
孵育另外一至两天，直到培养物达到90％的汇合

图4.未分化神经干细胞培养物在90％汇合时的差异干涉对比显微照片（比例尺=100μm）
在25℃下用2ml HBSS洗涤培养物，用精细镊子轻轻握住玻璃盖玻片的边缘，并将其转移到新的6孔板中，该孔含有2ml每孔不含bFGF（分化诱导培养基）的Neurosphere基础培养基。
每2天更换2ml分化诱导培养基。
分化6天后，将该培养基替换为在2ml的分化诱导培养基中以1：1,000稀释的朊病毒感染的脑匀浆。
感染两天后，用相同稀释度的新鲜制备的朊病毒感染的脑匀浆替换2ml培养基，继续孵育另外两天。
每2天更换分化诱导培养基，直到进行朊病毒的生化和感染性测定。

食谱

表皮生长因子人（EGF）
以50μg/ml溶于含有1％BSA的无菌DMEM/F12 Ham中溶解分装（100μl）并贮存在-20℃下在6个月内使用
成纤维细胞生长因子 - 碱性人（bFGF）
以50μg/ml溶于含有1％BSA的无菌DMEM/F12 Ham中溶解分装（50μl）并储存在-20℃下
在6个月内使用

神经球基础培养基

试剂	卷	最终浓度。
DMEM/F12 Ham	487.33 ml
EGF	500微升	50 ng/ml
bFGF	500微升	50 ng/ml
BSA	1.67 ml	0.1％
N2补助	5 ml	1％
青霉素 - 链霉素	5 ml	100 IU/ml和100μg/ml，分别为

纤连蛋白
将1mg纤连蛋白溶解于1ml无菌水中作为储备溶液
在使用前用水稀释原液（最终浓度为10ug/ml）
玻璃清洗溶液

试剂
卷
最终浓度。

EtOH（99.5％）
24 ml
74.6％

HCl（12.1mol/l）
8 ml
3.0 mol/l

分化诱导培养基

试剂	卷	最终浓度。
DMEM/F12 Ham	487.83 ml
EGF	500微升	50 ng/ml
BSA	1.67 ml	0.1％
N2补助	5 ml	1％
青霉素 - 链霉素	5 ml	100 IU/ml和100μg/ml，分别为

致谢

这个协议改编自我们以前发表的文章： Iwamaru （2013）。这项工作得到了日本农业，林业和渔业部BSE和其他朊病毒病防治项目的资助，以及来自该部的青年科学家资助（B类）日本教育，文化，体育，科学和技术。

参考文献

Iwamaru，Y.，Takenouchi，T.，Imamura，M.，Shimizu，Y.，Miyazawa，K.，Mohri，S.，Yokoyama，T.and Kitani，H。 Prion replication elicits 分化的神经球培养物中的细胞病变改变。病毒学87（15）：8745-8755。

Iwamaru，Y.，Takenouchi和Kitani，H。（2014）。神经球的分离和培养用于研究朊病毒病的发病机理 /em> 3（6）：e1081。