材料和试剂

小鼠（NCI）（BALB/c或C57BL/6,4周至18+月）
异氟烷（USP吸入蒸气，液体）（NDC：57319-559-06）
Dulbecco's改良的Eagle培养基高葡萄糖（DMEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：11965092）
Ketaset III氯胺酮HCl注射液（USP100mg/ml）（DEA Schedule II药物）（NDC：0856-2013-01）
100mg/ml注射甲苯噻嗪（Lloyd Laboratories，NADA号：139-236）
0.9％氯化钠灌注（USP）（Baxter，目录号：2F7124）
1×Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14190-144）
胶原酶D（Roche Diagnostics，目录号：11088882001）
DNase I（Roche Diagnostics，目录号：10104159001）
Hank's平衡盐溶液（HBSS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14025）
L-谷氨酰胺（200mM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：25030-081）
Hepes（1M）（Life Technologies，Gibco ，目录号：15630-080）
青霉素链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-122）
RPMI培养基1640（Life Technologies，Gibco ，目录号：11875-093）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250-100ML）
BD Golgi Plug ^TM（BD，目录号：554722）
正常大鼠血清（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：10710C）}
FITC抗小鼠CD8a克隆53-6.7（0.5mg/ml）（BD，目录号：553031）
PerCP-花青5.5抗小鼠CD4克隆RM4-5（eBioscience，目录号：45-0042-82）
胎牛血清（FBS）（Atlanta Biologicals，目录号：S11150）
叠氮化钠（AMRESCO，目录号：0639）
BD Cytofix/Cytoperm ^TM固定和透化溶液（BD，目录号：554722）
BD Perm/Wash ^TM缓冲液（BD，目录号：554722）
APC抗小鼠IFNγ克隆XMG1.2（eBioscience，目录号：17-7311-82）
氯胺酮溶液（见配方）
消化缓冲液（参见配方）
RP10（参见配方）
FACS缓冲区（参见配方）
细胞表面染色混合物（见配方）
细胞内染色混合物（见配方）

设备

Dessicator（Narang Medical，目录号：P37.1517P）
精密滑动针（25G×5/8）（BD，目录号：305122）
纱布海绵（4×4英寸）（由NDC的Pro Advantage ，目录号：P157118）
1ml注射器（BD，目录号：309659）
3ml注射器（BD，目录号：309657）
细胞过滤器（70μm尼龙）（BD，目录号：352350）
组织培养皿（60×15mm）（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353002）
96孔细胞培养物簇（带有盖的圆底）（Corning，Costar ，目录号：3799）
5ml聚苯乙烯圆底管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352054）
吸收垫（Covidien，目录号：949）
10ml注射器（BD，目录号：309604）
12孔细胞培养物簇（带盖的平底）（Corning，Costar ，目录号：3513）
1ml研磨转移移液管（Research Products International，目录号：147501-1S）
15ml螺旋盖管锥形（Sarstedt AG，目录号：62.554.002）
50ml锥形螺旋盖管（Sarstedt AG，目录号：62.547.004）
生物安全罩
喷雾瓶用70％乙醇
外科剪刀
聚苯乙烯泡沫
Pipetman p10
Pipetman p200
Pipetman p1000
CO <2>孵化器
移液助剂
小金属称重刮刀
镊子
Vortexer
振动器旋床
冷冻式台式离心机
血细胞计数器
流式细胞仪

程序

感染
1. 感染小鼠，如Fett等人（2014）。
灌注和去除肺
1. 安乐死小鼠通过腹膜内注射300微升氯胺酮/赛拉嗪溶液。将鼠标固定在手掌中，水平握住它，然后以与小鼠相切的浅角插入针头，慢慢地将氯胺酮/赛拉嗪分配到腹膜腔中。
2. 当鼠标完全麻醉时，通过用25 G×5/8针固定每个肢体将其固定在一块聚苯乙烯泡沫上。
3. 使用装满70％乙醇的喷雾瓶润湿小鼠的毛皮
4. 用剪刀切开腹腔和胸腔，首先从下腹部到动物的喉咙切开。打开腹腔暴露隔膜的下侧。用剪刀切开隔膜，然后取下胸腔，完全暴露心脏和肺
5. 用无菌PBS填充10ml注射器，并附上25G×5/8针。将针插入心脏的左心室，并顺利地将PBS分配到心脏。在慢慢地将PBS分配到心脏中的同时，使用镊子将右心房从心脏分离，从而允许血液从循环中排出。用5-7ml PBS灌注一般循环。从左心室取出针头，将其插入右心室，更直接灌注肺与剩余的3-5毫升PBS。没有显着疾病的肺应该容易灌注。
6. 切开心脏远离肺部，然后在切除气管和任何残留的结缔组织后从胸腔中取出肺。
7. 将肺放入12孔组织培养板的孔中。如果要收获多个肺，在PBS中放置肺，将板在冰上存储，然后在处理之前立即转移到干净的干井。
8. 用剪刀将肺切成很细的碎片。
9. 在15ml锥形管中用1ml转移移液管将切碎的肺转移至5ml消化缓冲液中。
10. 将管放置在振荡器旋转式烤架上，并在室温下轻轻旋转30分钟。
11. 将70微米的细胞过滤器放入60×15毫米组织培养皿。
12. 转移消化缓冲液和肺组织到细胞过滤器使用1毫升移液管。将一些应变缓冲液转移到50ml锥形管中，在组织培养皿中留下足够的液体，使得细胞滤网的筛网上的肺组织保持湿润。使用来自3ml注射器的柱塞的平端，使用小的光运动轻轻地按压并解离组织通过过滤器。用PBS间歇冲洗组织，以移动细胞通过过滤器。处理组织，直到只有结缔组织保留在过滤器上，并将剩余的消化缓冲液转移到50ml锥形管。
13. 在桶式台式离心机中在室温下以1,300rpm将50ml锥形管中的肺细胞旋转10分钟。
14. 倒出上清液并将细胞重悬于5ml RP10中
肽刺激和细胞染色
1. 使用血细胞计数器计数细胞。正常肺细胞计数可以从3百万到3千万或更多，这取决于感染的阶段和严重程度。
2. 以1,300rpm速度旋转细胞5分钟。
3. 在RP10中重悬细胞，每100μl100万个细胞
4. 在96孔圆底板中，将100μl细胞加入到含有高尔基塞的RP10的100μl中，浓度为2μg/ml，终浓度为1μg/ml。孔应含有指定量的肽。确保包括无肽对照的孔。在我们的SARS-CoV感染的样品中，我们常规地用浓度为1μM的肽刺激细胞。 SARS-CoV特异性肽S366（CD8; HNYKYRYL）和N353（CD4; VNFNFNGL）用于通过干扰素γ（IFN-γ）的细胞内细胞因子染色（ICS）鉴定病毒特异性CD8和CD4T细胞。这两个表位是H-2抗原决定簇，因此在BALB/c小鼠中被识别。
5. 在37℃，5％CO 2孵育细胞5小时。然后将细胞在4℃下保存过夜。
细胞表面染色
1. 在4℃下以1,000rpm旋转细胞5分钟，然后通过将平板倾倒入含有10％漂白剂（当使用SARS-CoV）或将片快速翻转到纸巾上的废物箱中来除去上清液。
2. 每孔加入100微升细胞表面染色混合物。通过将每个孔向上和向下移动几次来彻底混合
3. 在4℃下避光孵育15分钟。
4. 加入100μlFACS缓冲液，并在4℃下以1,300rpm离心细胞5分钟。除去上清液。加入100μl固定和透化溶液; 通过上下吹打数次彻底混合
5. 在4℃下避光孵育30分钟。
6. 如果使用SARS-CoV，细胞可以转移到新的96孔圆底板，然后从BSL3中取出。
7. 使用移液管，将固定和渗透溶液中的细胞通过70微米的细胞过滤器进入FACS管。
8. 重悬细胞在2ml的BD Perm/Wash TM缓冲液中，然后在4℃下以1,300rpm离心细胞5分钟。除去上清液。
细胞内染色
1. 重悬细胞在100微升细胞内染色混合物每个样品。轻轻涡旋试管充分混合
2. 在黑暗中孵育30分钟。
3. 重悬细胞在至少1毫升FACS缓冲液然后旋转细胞在1,300 rpm 5分钟在4℃。除去上清液。
4. 重悬细胞在100微升FACS缓冲液
5. 使用流式细胞仪获取FACS数据
  
  图1.用于鉴定SARS-CoV特异性T细胞应答的策略。用小鼠适应的SARS-CoV感染小鼠。 6-8天后，将小鼠安乐死，取出肺并制备用于流式细胞术的单细胞悬浮液。左侧面板显示单核细胞门。 CD4和CD8 T细胞被鉴定并评估IFN- size：12.0pt; font-family：Symbol;">
  食谱
  1. 氯胺酮溶液（10ml） 1.75 ml氯胺酮 0.25ml甲苯胺
    8毫升0.9％氯化钠灌注
    在室温下贮存
  2. 消化缓冲液（100ml）
    100mg胶原酶D
    10 mg DNase I
    2 ml FBS
    1 ml谷氨酰胺
    2.5 ml Hepes
    5ml青霉素链霉素 89.5ml HBSS
    储存于-20°C
  3. RP10（500ml） 50ml FBS
    500μl2-巯基乙醇（从50mM在H 2 O中制备的储备液） 450ml RPMI培养基1640
    储存在4°C
  4. FACS缓冲液（500ml） 1.7ml叠氮化钠（从H 2 O中制备的30％原液） 20ml FBS
    480 ml PBS
    储存在4°C
  5. 细胞表面染色混合物（100μl= 1个样品）
    1μl大鼠血清
    0.25μlCD4 PerCP-Cyanine5.5
    0.5μlCD8a FITC
    100μlFACS缓冲液
  6. 细胞内染色混合物（100μl= 1个样品）
    0.3μlIFNγAPC
    100μlBD Perm/Wash ^TM缓冲液
  致谢
  
  这项工作是由国家卫生研究院的拨款支持（PO1AI060699，RO1AI091322）。本文所述的方案基于以下手稿：Zhao等人（2010）。
  
  参考文献
  1. Fett，C.，DeDiego，M.L.，Regla-Nava，J.A.，Enjuanes，L.and Perlman，S。（2013）。通过用小鼠免疫在老年小鼠中完全保护免受严重急性呼吸综合征冠状病毒介导的致死性呼吸道疾病 - 适应缺乏E蛋白的病毒。 Virol 87（12）：6551-6559。
  2. Fett，C.，Zhao，J.C。和Perlman，S。（2014）。小鼠肺中的SARS-CoV的病毒感染和滴定。生物协议 4（6）：e1084。
  3. Netland，J.，DeDiego，M.L.，Zhao，J.，Fett，C.，Alvarez，E.，Nieto-Torres，J.L.，Enjuanes，L.and Perlman，在E蛋白中缺失的减毒性严重急性呼吸综合征冠状病毒的免疫保护免于致命的呼吸道疾病。 a> Virology 399（1）：120-128。
  4. Zhao，J.，Zhao，J.and Perlman，S。（2010）。 T细胞应答对于严重急性呼吸综合征冠状病毒感染的小鼠中的临床疾病和病毒清除是必需的。 84（18）：9318-9325。