材料和试剂

原代小鼠乳腺细胞的单细胞悬浮[参见Debnath等人（2003）关于小鼠乳腺解离成单个细胞的细节]
EpiCult ^？ -B Basal Medium Mouse（STEMCELL Technologies，目录号：05611）
EpiCult -B增殖补充剂（STEMCELL Technologies，目录号：05612）

台盼蓝

重组人表皮生长因子（EGF）（Sigma-Aldrich，目录号：E9644）

重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（Life Technologies，目录号：PHG0023）

肝素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：H3149）

胎牛血清（FBS）（热灭活）（Life Technologies，目录号：10270-106）

青霉素 - 链霉素（Pen/Strep）（Life Technologies，目录号：15070-063）

生长因子减少（GFR）BD Matrigel TM 基质[蛋白质浓度> 8mg/ml，内毒素水平< 2内毒素单位（EU）/ml]（BD Biosciences，目录号：354230） Matrix是以冻结的方式提供的。解冻在冰上过夜，并以1ml等分试样在-20℃下储存。离开 Matrigel等分试样在冰上解冻2小时后使用。

完成EpiCult-B Medium（见配方）

设备

BD Falcon 8孔培养载玻片（BD Biosciences，目录号：354108）

带旋转叶轮的冷冻离心机

加湿37℃，5％CO 2细胞培养箱

倒置组织培养显微镜

Zeiss Observer Z.1显微镜（5x/0.12目标）

软件

AxioVision Rel 4.8软件

ImageJ

程序

将8孔腔室载玻片置于冰上，并每孔加载80μlMatrigel。将基质胶滴定位在每个孔的中心，小心避免气泡形成。
注意：为了防止凝胶化，建议在冰上处理Matrigel。

接下来，将室滑板固定到用于回转桶式转子的预冷却适配器上，并且在4℃下以300×g离心（具有缓慢的加速斜坡）10分钟。 Matrigel层现在是平的并且均匀地分布在腔室的底部注意：在步骤2中使用一些塑料石蜡膜保持培养皿的盖子很方便。

然后将室玻片转移至细胞培养培养箱中，以使基质胶固化至少15分钟。

同时，将新鲜制备的单小鼠乳腺细胞重悬于Complete EpiCult-B培养基中并计数。
注意：台盼蓝染色是推荐用于活细胞计数的几种方法之一。

将细胞悬浮液在Complete EpiCult-B培养基中稀释，以获得25,000个活细胞/ml的最终浓度。

通过加入50μlMatrigel/ml完全EpiCult-B培养基并通过重复吹打混合来制备补充有5％Matrigel的Complete EpiCult-B培养基的储备物。

将来自步骤5的细胞悬浮液与来自步骤6的培养基以1:1的比例混合。将400μl的该混合物（其相当于Complete EpiCult-B Medium2.5％Matrigel中的5,000个细胞）逐步地平铺在来自步骤3（图1）的固化基质胶上。

将室玻片置于细胞培养箱中。细胞将沉积在固体Matrigel层上。

将覆盖液体培养基用每3天补充2.5％Matrigel的新鲜Complete EpiCult-B培养基替换。为了避免损坏底部凝胶层，从每个孔的角落吸出培养基，并沿着壁轻轻地分配新鲜培养基。

菌落将在培养10-14天后产生。代表图像如图2所示。

可以使用倒置显微镜，通过手动计数或者利用图像分析程序（例如Image J软件）的支持来确定集落数目。

图1.描述上述步骤7
的示意图

图2. 3D乳腺集落形成细胞测定。来自小鼠乳腺单细胞的3D培养物（第10天）的集落的相差图像。该图像通过使用Zeiss Observer Z.1显微镜（5x/0.12物镜）和AxioVision Rel 4.8软件获得。比例尺，100μm，

食谱

完成EpiCult-B培养基（50ml）
EpiCult-B基础培养基：42ml
EpiCult ^® -B增殖补充剂：5ml
FBS：2.5ml
Pen/Strep：0.5ml
EGF（0.2mg/ml）：2.5μl
肝素（50mg/ml）：4μl
通过0.2μm过滤器过滤灭菌
储存在4°C，并在一周内使用
完成EpiCult-B Medium必须在使用前立即用Matrigel补充

致谢

我们感谢Agata Tinnirello博士和Senthil Muthuswamy教授关于3D叠加细胞培养方法的技术建议（以前由Debnath等人（2003）描述），这项工作由AIRC资助（Grant IG2008和IG2011 ），MIUR（FIRB Giovani 2008），PiSTEM和ProgettoSanitàFinalizzata。G. Tornillo得到了FIRC研究金的支持。

参考文献

Debnath，J.，Muthuswamy，S.K.and Brugge，J.S。（2003）。在三维基底膜培养物中生长的MCF-10A乳腺上皮腺泡的形态发生和肿瘤形成。 a> 方法 30（3）：256-268

Tornillo，G.，Elia，AR，Castellano，I.，Spadaro，M.，Bernabei，P.，Bisaro，B.，Camacho-Leal Mdel，P.，Pincini，A.，Provero，P.，Sapino，A 。，Turco，E.，Defilippi，P。和Cabodi，S。（2013）。 p130Cas通过解除c-Kit活性来改变乳腺祖细胞的分化潜能。 em> Stem Cells 31（7）：1422-1433。