材料和试剂

稳定表达GFP-LC3的感兴趣的细胞系（HepG2，HUH7，CMK，K562等）我们推荐以下可商购的质粒：由来自Addgene的Jayanta Debnath产生的pBABEpuro GFP-LC3（质粒22405）和pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B（质粒22418）插入逆转录病毒构建体中并用于细胞转导
包含含有100U /100μg/ml青霉素/链霉素（Life Technologies，Gibco）的10％胎牛血清（FBS）的Eagle's最小必需培养基（EMEM）（ATCC，目录号：30-2003），目录号：15140-122）
含有含100U /100μg/ml青霉素/链霉素的10％胎牛血清（FBS）的L-谷氨酰胺RPMI 1640（Lonza，目录号：BE12-702F）
胎牛血清（FBS）（Biochrom，目录号：S0615）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Biochrom，目录号：L1825）
1x 0.05％胰蛋白酶-EDTA（酚红）（Life Technologies，目录号：25300）
含有6mM葡萄糖（饥饿培养基）的Hanks平衡盐溶液（HBSS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14025）
来自吸湿链霉菌（1-5μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：R0395）的雷帕霉素
PP242水合物（1-5μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：P0037）
3-甲基腺嘌呤（3-MA）（3-10mmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：M9281）
渥曼青霉素（30-100nmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：W3144）
LY294002（7-20μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：L9908）
诺可达唑（12-50μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：M1404）
长春花碱（12-50μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：V1377）
氯化铵（NH 4 Cl）（10-20mmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：A0171）
硫酸氢氯喹（HCQ）（5-10μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：H0915）
氯喹（CQ）（5-10μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：C6628）
二甲基亚砜DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）

设备

37℃，5％CO 2湿润培养箱
离心机
奥林巴斯IX81仪器和analySIS（软成像系统有限公司）或类似设备

程序

在湿润的培养箱中在37℃，5％CO 2下在标准组织培养条件下保持细胞。保持细胞密度低于1×10 6/sup/ml，并在亚汇合阶段进行分析。
注意：在分析之前，细胞应该在新鲜培养基中保持几个小时，以避免由于营养物耗尽而导致的自噬的潜在激活。一般培养基包含自噬影响物质：氨基酸，葡萄糖，生长因子，激素... 等。在比较不同条件下的自噬通量时要小心，以便对所有必要因素进行归一化。在分析不同物质对自噬的影响时，例如DMSO，乙醇等，可能会影响自动通量。
孵育细胞所需的时间和在感兴趣的条件下。
注意：当分析延长的时间段和/或潜在影响细胞数量或活力的条件下时，营养物消耗和因此丰度的差异可能发生并影响您的结果，因为自噬活性与营养状态高度相关。
阳性对照[雷帕霉素（1-5μmol/L），PP242（1-5μmol/L），含6mmol/L葡萄糖的Hanks平衡盐溶液（饥饿培养基）]和阴性对照[3-甲基腺嘌呤），枸杞素（30-100nmol/L），LY294002（7-20μmol/L），诺考达唑（12-50μmol/L），长春花碱还可以包括氯化铵（NH 4 Cl）（10-20mmol/L），氢氯喹（HCQ）或氯喹（CQ）（5-10μmol/L）]。阳性对照激活自噬，并应导致每个细胞的斑点数的初始增加。阴性对照抑制自噬过程的不同阶段。预期自噬体形成的抑制剂减少作为自噬体成熟或下游事件抑制剂的每个细胞的斑点数应导致每个细胞的斑点数量增加。

在孵育期结束时，将细胞转移到显微镜玻璃上，并对于每种单独的处理条件，从属于许多随机选择的具有GFP滤膜的细胞的几个细胞取荧光图像。
注意：

当分析某种物质或条件对自噬的影响时，我们建议评价每个细胞的自噬体数量的潜在变化，并与建立的激活剂和抑制剂的作用进行比较。
此外，在上述条件下进行一系列共孵育并且使用所提供的表1用于粗略取向是有益的。（注意：必须排除GFP-LC3聚集体形成可能引起的实验假象，使用具有稳定表达融合蛋白的GFP-LC3细胞，选择具有与最小聚集体形成相关的GFP-LC3表达水平的细胞克隆。 FM对于确定每个细胞的自噬体数目是有用的，它不是细胞自噬活性估计的良好指示剂。

自噬体积累可能是由于自噬诱导与自噬体的产生增加以及抑制自噬体成熟或下游事件和不能完成自噬途径。有几种方法可以区分这些情况。我们建议在表1中提供以下简单化模型。

表1.未知物质X的分析

X加：	中	激活者	iAF	iAM或iAA
I	→	↑↑	→或↓	↑↑
II	↑↑	↑↑↑	→或↑或↓	↑↑↑
III	→或↓	→或↑或↓	→	↑
IV	↑↑	↑↑↑	↑	↑↑

注意：通常自噬的药理学抑制剂缺乏特异性，因此可能发生一些细胞类型特异性效应。我们还建议分析一种新物质不仅对碱性，而且对雷帕霉素，PP242或饥饿激活的自噬通量的影响。表1可用于方便解释结果。
注意：

→↑↓：FM可视化自噬体数目的变化。
（激活剂）：自噬诱导[雷帕霉素（1-5μmol/L），PP242（1-5μmol/L）或饥饿培养基]。
（iAF）：自噬体形成的抑制[3-甲基腺嘌呤（3-MA）（3-10mmol/L），渥曼青霉素（30-100nmol/L），LY294002（7-20μmol/L）]。
（iAM）：抑制自噬体成熟[诺考达唑（12-50μmol/L）和长春碱（12-50μmol/L）]。
（iAA）：抑制自噬体的酸化[氯化铵（NH 4 Cl）（10-20mmol/L），氢氯喹（HCQ）和氯喹（CQ）（5-10μmol/L） br />
未知物质X的分析应包括与活化剂，iAF，iAM和/或iAA的共孵育。表1示出了四种可能的情况。 a）情况（I）未知物质X不影响细胞自噬活性; b）情况（II）X是活化剂; c）情况（III）X是自噬体形成的早期抑制剂; d）情况（IV）X抑制自噬体水平的自噬体成熟或在某些下游阶段。
注意：FM数据的建议解释应该谨慎使用，因为它本身FM容易有许多限制，并且使用这种方法获得的结果必须使用其他方法方法进行验证，没有重叠的限制，如电子显微镜（EM），流式细胞术，免疫印迹（WB）等。
示例数据：

图1.荧光显微镜分析在自噬抑制剂3MA（10mM）孵育6h的稳定表达LC3-GFP融合蛋白的3T3-F442A细胞中自噬噬斑形成在存在或不存在自噬激活物PP242的情况下的最后4天 h

致谢

这项工作得到了德国研究基金会（KFO 250，TP1）的部分支持，以及来自雅培的不受限制的资助。 Leverkus，M.由德国国家学术基金会（LE-953/5-1和LE-953/6-1）支持。 Behrens，G.获得EXC 62/1卓越集群的支持。

参考文献

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Sinicrope，F.A.，Sirko，A.，Siu，P.M.等人。（2012）。使用和解释用于监测自噬的测定法。自噬 8（4）：445-544。

Stankov，MV，El Khatib，M.，Kumar Thakur，B.，Heitmann，K.，Panayotova-Dimitrova，D.，Schoening，J.，Bourquin，JP，Schweitzer，N.，Leverkus，M.，Welte，K 。，Reinhardt，D.，Li，Z.，Orkin，SH， Behrens，G.M.和Klusmann，J.H。（2014）。组蛋白脱乙酰酶抑制剂通过抑制自噬在骨髓性白血病中诱导凋亡。 >白血病 28（3）：577- 588。

Stankov，M.V.，Panayotova-Dimitrova，D.，Leverkus，M.，Schmidt，R.E.and Behrens，G.M。（2013）。胸苷类似物抑制培养的脂肪细胞中的自噬和脂肪形成。抗微生物剂化疗 57（1）：543-551。