材料和试剂

稳定表达LC3-GFP的感兴趣的细胞系（HepG2，HUH7，CMK，K562等）我们推荐以下可商购的质粒：由来自Addgene的Jayanta Debnath产生的pBABEpuro GFP-LC3（质粒22405）和pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B（质粒22418）插入逆转录病毒构建体中并用于细胞转导
包含含有100U /100μg/ml青霉素/链霉素（Life Technologies，Gibco）的10％胎牛血清（FBS）的Eagle's最小必需培养基（EMEM）（ATCC，目录号：30-2003），目录号：15140-122）
含有10％FBS和100U /100μg/ml青霉素/链霉素的含有L-谷氨酰胺的RPMI 1640（Lonza，目录号：BE12-702F）
FBS（Biochrom，目录号：S0615）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Biochrom，目录号：L1825）
1x 0.05％胰蛋白酶-EDTA（酚红）（Life Technologies，目录号：25300）
含有6mM葡萄糖（饥饿培养基）的Hanks平衡盐溶液（HBSS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14025）
来自吸湿链霉菌（1-5μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：R0395）的雷帕霉素
PP242水合物（1-5μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：P0037）
3-甲基腺嘌呤（3-MA）（3-10mmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：M9281）
渥曼青霉素（30-100nmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：W3144）
LY294002（7-20μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：L9908）
诺可达唑（12-50μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：M1404）
长春花碱（12-50μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：V1377）
氯化铵（NH 4 Cl）（10-20mmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：A0171）
硫酸氢氯喹（HCQ）（5-10μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：H0915）
氯喹（CQ）（5-10μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：C6628）
二甲基亚砜DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）

设备

37℃，5％CO 2湿润培养箱
离心机
FACSCalibur，LSR II（BD）或类似设备

程序

保持细胞在标准组织培养条件下在37℃，5％CO 2在湿润的培养箱中。保持细胞密度低于1×10 6/sup/ml，并在亚汇合阶段进行分析。
注意：在分析之前，细胞应在新鲜培养基中保持几小时（最少12小时），以避免由于营养物耗尽而导致潜在的自噬激活。一般培养基包含自噬影响物质：氨基酸，葡萄糖，生长因子，激素等。在比较不同条件下的自噬通量时要小心，以便对所有必要因素进行归一化。在分析不同物质对自噬的影响时，例如DMSO，乙醇等，也可以影响自动通量。
孵育细胞所需的时间和在感兴趣的条件下。
警告：当在潜在影响细胞数量或活力的条件下分析长时间段时，营养物消耗和因此丰度的差异可能发生，并且影响您的结果，因为自噬活性与营养状态高度相关。 />
阳性对照[雷帕霉素（1-5μmol/L），PP242（1-5μmol/L），含有6mmol/L葡萄糖的Hanks平衡盐溶液（饥饿培养基）]和阴性对照[3-甲基腺嘌呤），枸杞素（30-100nmol/L），LY294002（7-20μmol/L），诺考达唑（12-50μmol/L），长春花碱还可以包括氯化铵（NH 4 Cl）（10-20mmol/L），氢氯喹（HCQ）或氯喹（CQ）（5-10μmol/L）]。阳性对照激活自噬，应导致总细胞LC3-GFP信号减少。阴性对照抑制自噬过程的不同阶段，通常应导致总细胞LC3-GFP的增加信号我们还建议分析一种新物质不仅对基础的，而且对雷帕霉素，PP242或饥饿激活的自噬通量的影响。
在孵育期结束时，将细胞转移至FACS管，将其置于冰上，并通过流式细胞术分析细胞计数的数据，作为在FL1通道上测量的GFP/FITC荧光强度。对于贴壁细胞，用DPBS洗涤一次，胰蛋白酶化，再次用DPBS洗涤，重悬于DPBS（2％FBS）中，置于冰上并分析。注意：通常自噬的药理学抑制剂缺乏特异性，因此可能发生一些细胞类型特异性效应。
表1可用于方便解释结果。

表1.未知物质X的分析

X plus
中
激活

I
→
↓↓

II
↓↓
↓↓↓

III
↑↑
↓或↑

注意：
1. →↑↓：LC3-GFP平均荧光强度（MFI）的变化。
2. （活化剂）：自噬诱导[雷帕霉素（1-5μmol/L），PP242（1-5μmol/L）或饥饿培养基]。建议的孵化时间为4至6小时。
3. 未知物质X的分析应包括与一种或多种激活剂的共孵育。表1示出了三种可能的情况。 a）情况（I）未知物质X不影响细胞自噬活性; b）情况（II）X是活化剂; c）情况（III）X是自噬的抑制剂。
4. 注意：虽然被认为是用于分析自溶通量的最准确的灵敏和可靠的方法，但是LC3-GFP周转的流式细胞术测定应当与具有非重叠限制的替代方法组合，例如电子显微镜（EM）荧光显微镜（FM），免疫印迹（WB）等。
5. 示例数据：
  
  图1.在存在或不存在通过饥饿（HBSS）的自噬激活（HBSS）（左）和自噬抑制剂3MA（10mM）孵育的表达LC3-GFP融合蛋白的K562细胞中的自噬通量的流式细胞术分析，右）

致谢

Stankov，M和Behrens，G由德国研究基金会（KFO 250，BE 2089/2-1和Excellence Cluster REBIRTH，EXC 62/1）支持。 Leverkus，M由德国研究基金会（LE-953/5-1和LE-953/6-1）支持。

参考文献

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Mizushima，N.，Yoshimori，T。和Levine，B。（2010）。哺乳动物自噬研究中的方法。 140（3）：313-326。
Stankov，MV，El Khatib，M.，Kumar Thakur，B.，Heitmann，K.，Panayotova-Dimitrova，D.，Schoening，J.，Bourquin，JP，Schweitzer，N.，Leverkus，M.，Welte，K 。，Reinhardt，D.，Li，Z.，Orkin，SH，Behrens，GM和Klusmann，JH（2014）。组蛋白脱乙酰酶抑制剂通过抑制自噬而诱导骨髓性白血病的凋亡。白血病 28（3）：577-588。
Stankov，M.V.，Panayotova-Dimitrova，D.，Leverkus，M.，Schmidt，R.E.and Behrens，G.M。（2013）。胸苷类似物抑制培养的脂肪细胞中的自噬和脂肪形成。抗微生物剂化疗 57（1）：543-551。