材料和试剂

伯基特氏淋巴瘤B细胞系（例如 Mutu ^-，Mutu I，Mutu III细胞系）
RPMI 1640培养基（Wako Chemicals USA，目录号：189-02025）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S7903）
抗CD63单克隆抗体（克隆MEM-250）（Abnova，目录号：MAB0931）
Bradford蛋白测定试剂盒（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006JA）
1,1'-二（十八烷基）-3,3,3'，3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）（Life Technologies，目录号：D3911）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F9423）
Tris
NaCl
EDTA
外来体耗尽的FBS（参见配方）
TNE缓冲区（参见配方）
0.25-2.5M蔗糖梯度在TNE缓冲液（见配方）中

设备

10厘米培养皿
离心机（Eppendorf，型号：5810R或同等设备规格）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima L-80 XP或具有同等设备规格）
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
自动移液器
50ml聚丙烯锥形塑料管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352070或具有同等规格的）
SW28转子（Beckman Coulter，型号：342204）
SW40Ti转子（Beckman Coulter，型号：331301）
用于SW28转子（Beckman Coulter，目录号：326823）的聚合物离心管1×3/2英寸（25×89mm）
用于SW41Ti转子（Beckman Coulter，目录号：331372）的聚合物离心管9/16×3/2英寸（14×89mm）
光谱仪
荧光或共焦激光扫描显微镜

程序

外来体的纯化
1. 伯基特氏淋巴瘤细胞系在200ml RPMI中从1×10 7个（在一个10cm培养皿中）培养至2×10 8个细胞（在二十个10cm培养皿中） 1640培养基在含有10％外来体缺失的FBS的培养基中在37℃下在5％CO 2培养箱中培养。
2. 文化收获含有外来体的培养基，并在50ml中离心锥形管在室温下以1,500rpm离心10分钟以除去细胞。
3. 将上清液在50ml锥形管中在室温下以3500rpm离心15分钟以除去细胞碎片
4. 将上清液在多聚体离心管中在25,000rpm下在4℃下用SW28转子超速离心1小时。
5. 将沉淀的外来体在4℃下在100μlTNE缓冲液中重悬浮过夜
6. 的外泌体通过使用0.25-2.5M蔗糖梯度 TNE缓冲液在多聚集体离心管中在4℃下以25,000rpm离心4小时与SW40Ti转子。之后，你会看到一个乐队派生自外来体（如果你从顶部收集每个级分1毫升，外来体馏分通常位于从顶部起约6个馏分）。
7. 用自动吸移管小心收集带（约1ml）。
8. 将分级外核体用SW40Ti转子在25,000rpm，4℃下超速离心1小时。
9. 将沉淀的外来体在4℃下在100〜200μlTNE缓冲液中重悬浮过夜
10. 通过Bradford蛋白质测定确定级分中的总蛋白质浓度
11. 的通过蛋白质印迹证实含有外来体的部分（4μg，每个）用抗CD63单克隆抗体（1:1000稀释）分析（图 1）。
  
  图1.源自伯基特氏淋巴瘤Mutu细胞系的纯化的外泌体。从Mutu细胞（第一泳道）的培养基中纯化外来体，Mutu 一世（第2泳道）和Mutu III（第3泳道）细胞。 4μg外来体通过用抗CD63的western印迹分析。箭头表示乐队对应于CD63。
荧光标记外来体
1. 1 ml的分级外来体（100ng/ml）与6μl的10μM温育 1,1'-二（十八烷基）-3,3,3'，6' 3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）在甲醇中1小时在室温下黑暗，轻轻搅拌
2. 在荧光或共焦激光扫描显微镜下确认用少量外来体标记的效率
3. 等分试样，储存于-80℃

食谱

外来体耗尽的FBS
超速离心机FBS在25,000rpm，4℃，4小时收集上清液并在4℃下保存
TNE缓冲区
10mM Tris-HCl（pH7.6） 100 mM NaCl
1mM EDTA
在室温下贮存
0.25-2.5M蔗糖梯度在TNE缓冲液中在TNE缓冲液（图2）中制备0.25M和2.5M蔗糖
1. 将2.5M蔗糖溶液填充至多聚离心管的高度的一半（约6ml）
2. 在层中加入0.25M蔗糖溶液至管顶部（约6ml），并用橡皮塞
  塞住试管
3. 放置管的顶部稍高于底部（使用薄管浮子作为枕头）用于室温1.5小时
4. 慢慢地放置管，并保持在4°C，直到使用前（可储存达2天）
图2.在TNE缓冲液中制备0.25-2.5M蔗糖梯度。（a）将2.5M蔗糖溶液填充至高度的一半多聚集体离心管（约6ml）。（b）加入0.25M 蔗糖溶液，直到管的顶部（约6ml）并用橡胶塞塞住管子。（c）放下管子顶部略高于底部（使用细管浮子作为枕头）为在室温下至少1.5小时。（d）慢慢站立管并保持在4°C，直到就在使用前（可储存达2天）

致谢

该协议已经从先前发表的文章（Nanbo等人，2013年）改编。这项工作得到了住友基金会的基础科学研究项目资金拨款的支持; 秋山生命科学基金会; 科学研究助学金; 资生堂女研究员科学资助; 佐川促进癌症研究基金会。

参考文献

Nanbo，A.，Kawanishi，E.，Yoshida，R。和Yoshiyama，H。（2013）。外来体来源于Epstein-Barr病毒感染的细胞 caveola依赖内吞和促进表型调节靶细胞。 Virol 87（18）：10334-10347。
Nanbo，A.，Imai，M.，Watanabe，S.，Noda，T.，Takahashi，K.，Neumann，G.，Halfmann，P.and Kawaoka，Y。埃博拉病毒通过内部化到宿主细胞中 > macropinocytosis in a viral glycoprotein-dependent manner。 PLoS Pathog 6（9）：e1001121。