图1.复合糖蛋白的夹心ELISA分析

材料和试剂

细胞壁提取物[50mM环己二胺四乙酸（CDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：D1383）或4M KOH/1％（w/v）NaBH 4 ：452882）或纯化的细胞壁聚合物] 注意：
1. 细胞壁提取物的试剂是50mM环己二胺四乙酸（CDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：D1383）或4M KOH/1％（w/v）NaBH 4（Sigma-Aldrich，目录号：452882）
2. 使用4M KOH/1％（w/v）NaBH 4的细胞壁提取方案描述于Cid et al。（2010）。这种提取将破坏和释放大多数细胞壁聚糖。
3. CDTA是用于从细胞壁特异性提取果胶级分的螯合剂。使用50mM CDTA代替4M KOH（不需要中和步骤）可以遵循相同的方案。
脱脂奶粉（Marvel Original）[以1％PBS中的5％（w/v）使用]
纯化的重组碳水化合物结合模块（CBM）
注意：用于CBM表达和纯化的方案可以在Lee et al。（2013）。
主要单克隆抗体（PlantProbes， www.plantprobes.net ）
二抗（取决于所用一抗的来源）
1. 抗大鼠IgG-辣根过氧化物酶（HRP）缀合（Sigma-Aldrich，目录号：A9542）
2. 抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶（HRP）缀合（Sigma-Aldrich，目录号：A6782）
10mg/ml四甲基联苯胺（Sigma-Aldrich，目录号：T2885）
1M乙酸钠缓冲液（pH 6）
6％H 2 O 2（VWR International，目录号：2858175C）
2.5 M H sub SO SO 4（VWR International，目录号：191675A）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P2287）（任选）
1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7）（参见配方）
HRP开发解决方案（参见配方）

设备

96孔表面处理的ELISA微量滴定板（Thermo Fisher Scientific，Nunc-Immnuno Maxisorp，目录号：442404）
微量滴定板读数器（450nm吸光度）（Thermo Fisher Scientific，Multiskan FC微孔板光度计）
多通道移液器（如果可用，不重要）
pH计

程序

使用0.5至1μg/ml CBM的1×PBS，每孔100μl在4℃过夜包被微量滴定板。
注意：获得良好信号所需的CBM的量将根据其对底物的亲和力而变化。可能需要进行试验以找到适当的稀释度。
微量滴定板读数器（450nm吸光度）（Thermo Fisher Scientific，Multiskan FC微孔板光度计）
多通道移液器（如果可用，不重要）
pH计

程序

使用0.5至1μg/ml CBM的1×PBS，每孔100μl在4℃过夜包被微量滴定板。
注意：获得良好信号所需的CBM的量将根据其对底物的亲和力而变化。可能需要进行试验以找到适当的稀释度。
Incubate with a primary antibody appropriately diluted in 5% (w/v) milk/1x PBS, 100 µl per well for 1 h at room temperature.
Note: Use 10x dilution of hybridoma cell culture supernatants if working with PlantProbes monoclonal antibodies.
Wash the plate 6 times using tap water or 1x PBS 0.1 % (v/v) Tween 20. Shake the plate dry.
Incubate with secondary HRP-conjugated antibody diluted 1:1,000 in 5% (w/v) milk/1x PBS, 100 µl per well for 1 h at room temperature.
Wash the plate 9 times using tap water or 1x PBS 0.1 % (v/v) Tween 20. Shake the plate dry.
Note: Plates should be thoroughly washed at this step to ensure no false positive signals due to non-specifically bound secondary antibody/HRP.
Develop the plate using 150 µl of substrate solution per well to detect secondary antibody binding. Let the plates develop for 5 to 10 min. Stop the reaction by adding 50 µl of 2.5 M sulphuric acid.
Note: As developing the plate is a time dependent process it is important to ensure that all comparable samples are developed for the same time.
To collect the data, read the plates at 450 nm using the microtitre plate reader.

Notes

Make sure all experimental combinations in the microtitre plate wells are assayed in triplicates.
A control with no CBM (1x PBS) needs to be included in every experiment. This should remain blank if the plates are properly blocked. In case of a signal in no CBM wells increase the % of milk powder, block for longer or use >3% Bovine Serum Albumin in place of milk powder.

Recipes

1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7）
1. 为了制备该缓冲液，需要将NaH 2 PO 4 4加入到0.6712摩尔/L和Na 2 HPO 4中，到0.3288摩尔/L
2. 使用Henderson-Hasselbalch方程[pH = pKa + log（Base）/（Acid）]计算酸和碱的量。
3. 使用正确量的NaH 2 PO 4和Na 2 HPO 4来制备刚好在1升溶液下， in dH ₂ O。
4. 使用pH计检查pH，如果需要，使用磷酸或氢氧化钠稍微调整。
5. 一旦调整pH，将体积调至1L。
HRP显影液（50ml）
将45ml dH 2 O与5ml 1M乙酸钠缓冲液（pH 6）混合
加入500μl四甲基联苯胺
在最后一分钟，加入50μl的6％H 2 O 2 sub 2
注意：加入过氧化氢可启动反应。因此，在最后一分钟添加它以避免高背景信号是很重要的。

致谢

导致该议定书的研究得到了WallTraC项目（授予协议n 263916）下欧洲联盟第七框架计划（FP7 2007-2013）的资助。本文仅反映作者的观点。欧洲共同体对可能对本文所包含的信息进行任何使用不承担任何责任。

参考文献

Cid，M.，Pedersen，H.L.，Kaneko，S.，Coutinho，P.M.，Henrissat，B.，Willats，W.G.and Boraston，A.B。（2010）。通过新的碳水化合物结合家族识别β-1,4-半乳聚糖的螺旋结构模块。 J Biol Chem 285（46）：35999-36009。

Lee，K.J.，Cornuault，V.，Manfield，I.W.，Ralet，M.C.and Knox，J.P。（2013）。烟草种子胚乳细胞中果胶鼠李糖半乳糖醛酸I（RG-I）结构特征的多尺度空间异质性墙壁。植物J 75（6）：1018-1027