材料和试剂

金黄色葡萄球菌亚种 aureus USA300
干冰
二甲基亚砜（DMSO）（Thermo Fisher Scientific，目录号：D128-1）
多克隆抗Hla抗体（Abcam，目录号：ab15948）
与辣根过氧化物酶偶联的抗α溶血素（Hla）抗体（Abcam，目录号：ab15949）
3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）（Sigma-Aldrich，目录号：T4444）
停止试剂（Sigma-Aldrich，目录号：S5689）
Luria肉汤（LB）琼脂平板
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH7.2）（Sigma-Aldrich，目录号：P5119）
10mg/ml PBS中的牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：P3688）（参见Recipes）
0.05％Tween 20的PBS溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P3563）（参见Recipes）
胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）（参见配方）

设备

-80°C冰箱
14ml聚丙烯培养管（BD，目录号：352059）
棉球或防溅帽
微量滴定96孔EIA/RIA板（Corning，Costar ^TM，目录号：9017）
微量板读数器（Molecular Devices，型号：SPECTRA Max M2）或能够测量OD 650nm的96孔微量滴定板的任何其它模型
注意：如果使用不同型号的酶标仪，请确保使用适当的微量滴定板96孔板样品，因为上述样品可能无法正常工作。
37℃摇床
丁腈手套
多通道移液器（Eppendorf）
0.22μm注射器过滤器（PVDF）（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand ^TM，目录号：09-720-3）
3ml鲁尔锁注射器（BD，目录号：309657）
1.5英寸针（BD，目录号：305187）
2 ml cryotubes
塑料包装
一次性接种环（10μl，PS，无菌，黄色）（LPS，目录号：M122002）

软件

Microsoft Excel或其他数据处理程序

程序

诱导α溶血素（Hla）
1. 从-80℃冰箱中取出MRSA菌株USA300的冷冻菌群，并直接置于干冰上。
  注意：股票不解冻。
2. 使用无菌一次性接种器环，刮下接种物从细菌原液中并置于含有1.5ml的培养管中的TSB。
  注意：不需要使用无菌技术，但应注意尽量减少可能的污染。
3. 将棉球放在培养管的顶部，并将盖子松松地放置
4. 将培养物在37℃振荡培养过夜，16-18小时注意：棉球是防止文化溢出的预防措施。
5. 将单个过夜培养物在足够的TSB中以1:100稀释至等分每个处理使用1.960ml稀释的培养物（待测化合物） DMSO）注意：为了确定培养物稀释所需的TSB的最终体积，使用以下计算：
  （治疗次数）x 2 ml + 1 ml = ml TSB。
6. 制备溶液0.05mg/ml，0.5mg/ml或2.5mg/ml的化合物的感兴趣（潜在的MRSA抗毒力剂）在100％DMSO中。（一感兴趣的化合物的实例是二氟尼柳，更多实例参见参考1.）
7. 40μl的100％DMSO，0.05mg/ml，0.5mg/ml或2.5 将mg/ml的化合物在100％DMSO中的溶液加入到14ml塑料培养物中以产生最终浓度为2％DMSO，1μg/ml，10μg/ml，和 50μg/ml的化合物。
  注意：
  1. 浓度使用取决于目标化合物的性质。
8. 将1.960ml 1:100稀释的过夜培养物加入含有化合物或DMSO的每个培养管中
9. 将来自步骤A5的1：100稀释液的剩余物置于冰上
10. 与过夜培养一样，将棉球放置在每个培养管的顶部，并且松散地放置盖子。
11. 将来自步骤A8的管在37℃下振荡孵育6小时。
培养物的稀释以确定菌落形成单位（CFU）
1. 将置于冰上的1：100稀释的过夜培养物在A部分中以1:10 ^{4和1:10 ^{5的比例连续稀释到TSB中。}}
2. 将100μl的1:10 4和1:10稀释物铺在LB琼脂上并搁置，直到所有的板都准备好。这是零小时时间点。
3. 6小时后，处理的培养物从37℃摇床中取出，并按照C部分进行第一次处理在进行以下稀释之前的协议
4. 将每个处理的样品中剩余的液体培养物连续稀释至1:10 ^{和1:10 ⁵。}
5. 将100μl的1:10和1:10稀释物铺在LB琼脂平板上。
6. 所有板（包括零时时间点板）在37℃下孵育过夜
7. 对每个1:10稀释板中的菌落数进行计数注意：如果在1:10平板上有少于30个菌落，则计数该样品的1:10稀释板。如果统计功效是利息，两盘都应计算。
用于ELISA的细菌培养物样品制备
1. 在孵育6小时后，将细菌培养物吸入鲁尔用1.5英寸针头锁定注射器，然后取出针注意：用镊子或止血钳取出针头，放入漂白并在硬的塑料锐器容器中处理。
2. 将0.22μm过滤器紧紧放置在注射器上，将细菌培养物过滤到2ml电泳管中注意：如果在过滤时存在阻力，则对其施加轻微的压力注射器的柱塞将推动滤液通过。太多了压力可能导致过滤器故障。
3. 将滤液立即用干冰冷冻并储存在-80℃备用注意：此时的滤液是无菌的，但在整个方案中仍应使用丁腈手套处理。
α-溶血素（Hla）ELISA
1. 准备稀释1：1000 Hla抗体。对于每个使用的96孔板， μl的抗Hla抗体加入到10ml冷PBS（pH7.2）中，（1：1,000稀释），并轻轻混合
2. 100μl的1:1000 将抗-H1a抗体的PBS加入每个微量滴定板96孔中，盖上用塑料包裹并在4℃下孵育过夜
3. 的除去上清液并通过加入短暂洗涤（即，冲洗）一次 230μl的0.05％Tween 20的PBS溶液，然后除去上清液。不需要搅拌。
4. 向每个孔中加入230μl在PBS溶液中的10mg/ml BSA，并置于4℃下60分钟
5. 除去上清液，通过加入230将板洗涤一次 μl的0.05％Tween 20的PBS溶液，然后除去上清液
6. 100μl的1:1000 将抗-H1a抗体的PBS加入每个微量滴定板96孔中，盖上用塑料包裹并在4℃下孵育过夜
7. 的除去上清液并通过加入短暂洗涤（即，冲洗）一次 230μl的0.05％Tween 20的PBS溶液，然后除去上清液。不需要搅拌。
8. 向每个孔中加入230μl在PBS溶液中的10mg/ml BSA，并置于4℃下60分钟
9. 除去上清液，通过加入230将板洗涤一次 μl的0.05％Tween 20的PBS溶液，然后除去上清液
10. The supernatant is removed and the 230 µl of 0.05% Tween 20 in PBS is added to each well. The supernatant is subsequently removed.
11. Step D33 is repeated 2 more times.
  Note: On the final wash, using a pipette ensure the removal of all 0.05% Tween 20 in PBS.
12. 230 µl of PBS (pH 7.2) is added to each well and subsequently removed.
13. Step D35 is repeated.
14. The plate is placed upside down onto a paper towel until all of the supernatant is drained.
15. 100 µl of substrate solution 3,3’,5,5’ tetramethylbenzidine (TMB) is added to each well and incubated at room temperature for 10 min.
16. 100 µl of stop reagent is added to each well.
  Note: Air bubbles may form when stop reagent is added. Prior to measuring absorbance, all air bubbles should be popped. This can be done by blowing air with a pipette, but should be done with care to avoid cross contamination between wells.
17. For each well in the plate, the OD is read at 650 nm using a microplate reader.
Calculations
1. The colony forming units (CFU) per ml for each treated sample is calculated by: [(# of colonies of treated sample) x (culture dilution factor)]/(# ml plated) = CFU/ml. This step can be done using Microsoft Excel or similar program.
  Notes:
  1. 0.1 ml of diluted culture is generally plated.
  2. The comparison CFU/ml of treated with the CFU/ml of the time zero plate is used to determine if the compounds are bactericidal, 抑菌，或对生长没有影响。如果CFU/ml治疗样品在统计学上与时间零的CFU/ml相同，则化合物抑制细菌生长。如果处理的样品的CFU/ml 统计学上小于时间零的，那么化合物杀死细菌。
2. Hla产量的量由下式计算 OD650通过：[（平均OD样品） - （平均OD空白）]×（样品稀释度因子）/（加入#ml样品）=单位/ml 注意：
  1. 通常每孔加入0.1ml样品。
  2. 使用Excel或类似程序即可轻松完成此操作。
3. 首先通过以下方式相对于CFU确定Hla的量：（＃单位/ml）/（＃CFU/ml）=单位/CFU。
4. 产生的百分比Hla定义为：[（单位/CFU处理）/（单位/CFU DMSO）]×100 =％Hla产生。注意：
  1. 如果％Hla产量低于100％，那么该化合物抑制Hla相对于DMSO的产生。
  2. 主Excel模板（附加此处）提供了示例数据对于细菌滤液的1:8稀释。模板将一旦OD值和菌落计数自动计算步骤E41-44 。请注意，模板是为卷和稀释度。如果其他体积或稀释度则需要在模板中进行调整。
图1.相对于DMSO处理的MRSA细菌培养物的百分比Hla产生的示例图（来自示例Excel模板）

食谱

10mg BSA/PBS中解决方案是按照制造商的指示
0.05％Tween 20的PBS溶液
解决方案是按照制造商的指示
胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）
17.0g细菌胰蛋白胨 3.0克Bacto Soytone
2.5克右旋糖 5.0克氯化钠
2.5g磷酸氢二钾（pH至7.3）

致谢

我们感谢Barbara Truitt和Michelle Pesho博士对本议定书的发展所作的贡献。该协议已经改编自John R Crowther，（2000）。这项工作的资金由来自美国心脏协会，大河伙伴关系公司的授权和Steris基金会的资助提供。

参考文献

Crowther，J.R。（2000）。 ELISA指南。 Methods Mol Biol 149：III -IV，1-413。
Khodaverdian，V.，Pesho，M.，Truitt，B.，Bollinger，L.，Patel，P.，Nithianantham，S.，Yu，G.，Delaney，E.，Jankowsky，E。和Shoham， 2013）。发现抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌的抗病毒剂。 Antimicrob Agents Chemother 57（8）：3645-3652。