材料和试剂

石蜡切片（皮下肿瘤样品或分别从皮下或脾内注射CRC细胞的裸鼠的肝转移）
XILOL
注意：二甲苯也称为二甲苯或二甲苯是在组织学中用作清除剂的溶剂，以在染色前从干燥的显微镜载玻片上除去石蜡。
MilliQ H sub 2 O 2 /
洗涤缓冲液（Dako，目录号：K800721）
兔抗P-Smad2（Cell Signaling Technology，目录号：3108）
BrightVision poly-HRP抗兔（Immunologic，目录号：DPVR-110HRP）
Envision FLEX抗体稀释剂（Dako，目录号：K8006）
过氧化物酶封闭溶液（Dako，目录号：S202386）
ImmPACT DAB（Vector Laboratories，目录号：SK-4105）
DPX安装介质（Sigma-Aldrich，目录号：06522）
苏木精
柠檬酸盐缓冲液（pH 6）（参见配方）

设备

烤箱
免疫染色仪
高压灭菌器

程序

在开始免疫染色技术之前在65℃下烘烤样品。当存在于切片中的蜡完全去除时，从烘箱中取出样品
脱蜡和再水合：将玻片放在架子上进行以下洗涤（浴）。
1. XILOL：10分钟
2. XILOL：10分钟
3. XILOL：5分钟
4. 100％EtOH：10分钟
5. 100％EtOH：5分钟
6. 96％EtOH：5min
7. 90％EtOH：10-15倍
8. 80％EtOH：10-15倍
9. 70％EtOH：10-15倍
10. 50％EtOH：10-15倍
11. 25％EtOH：10-15倍
12. H 2 O MilliQ：10-15次
抗原检索。
1. 柠檬酸盐缓冲液（pH 6）
2. 时间：20分钟高压釜（121℃）
3次用1ml 1x洗涤缓冲液洗涤5分钟
阻断内源性过氧化物酶。
1. 200 ml过氧化物酶封闭溶液
2. 时间：10分钟
3次用1ml 1x洗涤缓冲液洗涤5分钟
与第一抗体孵育。
1. 抗体：兔抗P-Smad2
2. 稀释1/200在Envision FLEX抗体稀释剂
3. 200μl/样品
4. O/N 4℃
3用1ml 1x洗涤缓冲液洗涤5分钟。
与抗体BrightVision孵育。
1. Antiboby：BrightVision anti-Rabbit
2. 150μl/样品
3. 时间：室温下45分钟
3用1ml 1x洗涤缓冲液洗涤5分钟。
揭示了ImmPACT DAB。
1. 200μl/sample
2. 时间：10分钟
3用蒸馏水洗涤5分钟
苏木素（1ml）复染色，时间：2分钟。
用蒸馏水冲洗。
在TAP水浴中冲洗。
用DPX脱水和安装。

代表数据

图1.在脾细胞注射CRC细胞后产生的肝转移中的p-SMAD2染色（箭头）。E：上皮细胞，Str：基质细胞。比例尺=10μm

食谱

柠檬酸缓冲液（pH 6）
柠檬酸盐5.8g柠檬酸钠
用柠檬酸调节pH 6 2 L MilliQ

致谢

A.C.和D.V.F.T拥有Juan de la Cierva博士后研究金，E.E.一名FPI博士研究生奖学金（均来自西班牙科学和创新部）。这项工作得到了Salud Carlos III FEDER研究所（RD09/0076/00036）和"加拿大肿瘤学院院长赞助的肿瘤研究"（XBTC）给予E.B.的资助。从欧洲研究理事会（启动补助金 - 208488）和Consolider计划（MICINN）到E.S. 由西班牙科学和创新部授予JM，NIH授予JM，CA34610授予JM，通过授予PS09/00965（MICINN）和NanoCoMets（CIBERBBN）授予RM。

参考文献

Calon，A.，Espinet，E.，Palomo-Ponce，S.，Tauriello，DV，Iglesias，M.，Cespedes，MV，Sevillano，M.，Nadal，C.，Jung，P.，Zhang，XH，Byrom D.，Riera，A.，Rossell，D.，Mangues，R.，Massague，J.，Sancho，E。和Batlle，E。（2012）。结肠直肠癌对基质细胞中TGF-β驱动程序对转移起始的依赖性。 a> Cancer Cell 22（5）：571-584。