材料和试剂

目标单元格
37％甲醛（Nacalai Tesque，目录号：16223-55）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G7126）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9625）
Agarose S（Wako Pure Chemical Industries，目录号：318-01195）
1M Tris（pH6.8）（AppliChem GmbH，目录号：A4987）
1M Tris（pH7.5）（AppliChem GmbH，目录号：A4263）
1M Tris（pH 8.0）（AppliChem GmbH，目录号：A4577）
0.5M EDTA（pH8.0）（Nacalai Tesque，目录号：14362-95）
0.1M EGTA（Nacalai Tesque，目录号：08947-35）
IGEPAL CA-630（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
Triton X-100（Nacalai Tesque，目录号：25987-85）
10％SDS溶液（Nacalai Tesque，目录号：30562-04）
8 M LiCl溶液（Nacalai Tesque，目录号：20077-84）
2-巯基乙醇（Nacalai Tesque，目录号：21438-82）
蔗糖（Nacalai Tesque，目录号：30404-45）
溴酚蓝（Nacalai Tesque，目录号：05808-61）
Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P5927）
脱氧胆酸钠盐一水合物（Nacalai Tesque，目录号：10712-12）
30％月桂酰肌氨酸（Nacalai Tesque，目录号：20135-14）
Dynabeads-protein G（Life Technologies，目录号：DB10004）
抗FLAG M2抗体（Sigma-Aldrich，目录号：F1804）
正常小鼠IgG（Santa Cruz，目录号：sc-2025）
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH7.4）（Nacalai Tesque，目录号：27575-31）
PBS（10×PBS用蒸馏水稀释10倍）
BSA级分V（7.5％）（Life Technologies，目录号：15260）
Complete，mini，无EDTA蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics，目录号：4693159）
10mg/ml RNA酶A（Sigma-Aldrich，目录号：R6513）
20mg/ml蛋白酶K（Roche Diagnostics，目录号：3115828）
3x FLAG肽（Sigma-Aldrich，目录号：F4799）
2-丙醇（Nacalai Tesque，目录号：29113-95）
3 M乙酸钠缓冲液（pH 5.2）（Nacalai Tesque，目录号：06893-24）
20mg/ml糖原（Roche Diagnostics，目录号：901393）
70％乙醇
4-20％微型PROTEAN TGX凝胶（10孔，50μl）（Bio-Rad Laboratories，目录号：456-1094）
用于SDS-PAGE（Tris-甘氨酸）（Nacalai Tesque，目录号：30329-74）的10x运行缓冲液溶液
考马斯亮蓝R-250染色溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0436）
凝胶胰蛋白酶消化试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：89871）
1.25M甘氨酸溶液（200ml）（参见配方）
10％脱氧胆酸钠（10ml）（参见配方）
10％Tween-20（10ml）（参见配方）
细胞裂解缓冲液（CLB）（40ml）（参见配方）
核裂解缓冲液（NLB）（40ml）（参见配方）
改性裂解缓冲液3（MLB3）（10ml）（参见配方）
PBS-T（10ml）（参见配方）
PBS-T-BSA（10ml）（参见配方）
5％Triton X-100（在MLB3中）（5ml）（参见配方）
低盐缓冲液（LSB）（10ml）（见配方）
高盐缓冲液（HSB）（10ml）（见配方）
LiCl缓冲液（20ml）（见配方）
TBS-IGEPAL CA-630（10ml）（参见配方）
洗脱缓冲液（500μl）（参见配方）
2x样品缓冲液（50ml）（见配方）

设备

磁性架（魔法捕集器）（TOYOBO，目录号：MGS-101）
离心机
1.5ml离心管（Sarstedt AG，目录号：72.690.001）
2ml离心管（Eppendorf，目录号：0030.120.094）
50ml离心管（BD Biosciences，目录号：352070）
涡流搅拌器
旋转器
真空泵连接到侧臂瓶
超声波破碎机（超声破碎机UD-201）（TOMY SEIKO，目录号：UD-201）
振动器
质谱设备：由与nanoLC（Advance CaptiveSpray SOURCE，Michrom BioResources）和HTC-PAL自动进样器（CTC Analytics）结合的LTQ Orbitrap Velos（Thermo Fisher Scientific）构成的nanoLC-MS/MS系统

程序

细胞的制备
1. 设计识别目标基因组区域中特定序列（约20个碱基）的TAL蛋白的DNA结合模块。
2. 在待分析的细胞中表达与3x FLAG标签和NLS融合的TAL蛋白。 enChIP的标记TAL蛋白的实例在参考文献（Fujita等人，2013）中的补充图1中示出。
甲醛交联的细胞
1. 培养靶细胞。使用2×10 7个细胞×2（总共4×10 7个细胞）（例如Ba/F3）用于染色质制备。收集悬浮在培养基（2×10 7个细胞/30ml）中的细胞在50ml离心管中（如果需要，增加细胞数）。准备2个管（总共4×10 7个细胞）
2. 加入810微升37％甲醛至1％终浓度至30毫升的细胞悬浮液。甲醛溶液有害，因此在化学罩中戴手套处理。在37℃孵育5-10分钟（通常为5分钟）。交联使细胞悬浮液的颜色略微发黄。
3. 通过加入3.1ml 1.25M甘氨酸溶液至终浓度127mM来终止交联。在室温下孵育10分钟。
4. 通过离心（300×g，4℃，5分钟）收集细胞。通过倾析小心地弃去上清液，包括甲醛，并将其存储在废液瓶中
5. 通过涡旋将固定的细胞（沉淀）重悬在30ml PBS中。通过离心（300×g，4℃，5分钟）收集细胞。通过倾析小心地弃去上清液，包括甲醛，并将其存储在废物瓶中。
6. 重复步骤B5（总共两次）。甲醛废物应根据实验室的化学安全指南进行处理。
7. 继续步骤C1，或者可以将具有固定的细胞（沉淀）的离心管冷冻并储存在-80℃。
染色质的制备（每2×10 7个细胞）
1. 将固定的细胞重悬在10ml CLB中。如果在步骤B6中固定的细胞被冷冻，则在添加CLB之前应该将其解冻。在冰上孵育10分钟。
2. 在4℃下以930×g离心8分钟。通过真空抽吸小心弃去上清液。
3. 将沉淀重悬于10ml NLB中。在冰上孵育10分钟。每2-3分钟在最大设置涡旋2-3秒。
4. 在4℃下以930×g离心8分钟。通过真空抽吸小心弃去上清液。
5. 将沉淀重悬在10ml PBS中。在4℃下以930×g离心10分钟。通过真空抽吸小心地弃去上清液。将沉淀用作染色质级分。
6. 进入步骤D1或带有染色质部分的离心管在液氮中立即冷冻后可储存在-80℃。
染色质的超声处理（每2×10 7个细胞）
1. 重新悬浮收集的染色质部分在800μl的MLB3。将悬浮液转移到1.5 ml微管中
2. 使用超声波破碎机UD-201超声处理染色质。条件如下：
  输出：3
  税率：100％（连续）
  时间：免费
  10-18个循环的超声处理10秒，并在冰上冷却20秒在冰上2分钟，5-6个循环后，以避免过度加热
  使用夹子或手保持超声处理棒尖端的位置离管底约0.5cm，以避免起泡。
3. 在4℃下以16,000×g离心10分钟。转移上清（800微升）到1.5毫升管。具有上清液的1.5ml管可以在液氮中立即冷冻后储存在-80℃
染色质断裂的评价
1. 重悬10微升碎片染色质在85微升蒸馏水。
2. 加入4μl的5 M NaCl。在65℃孵育过夜。
3. 加入1微升10毫克/毫升核糖核酸酶A.在37℃下孵育45分钟
4. 加入2μl0.5M EDTA（pH8.0），4μl1M Tris（pH6.8）和1μl20mg/ml蛋白酶K.在45℃下孵育1.5小时。
5. 准备1％琼脂糖凝胶，不染色染料
6. 使用10μl在步骤E4中制备的样品在不染色染料的1％琼脂糖凝胶中电泳。在100 V下运行凝胶30分钟。应加载1 kbp DNA梯形图标记以估计DNA断裂
7. 用染色染料（例如溴化乙锭）染色凝胶0.5-1小时（图1A）。 DNA断裂的一个例子如图1B所示。 DNA片段化的可接受范围取决于靶基因组区域的长度。通常，DNA断裂的范围通常应为4-0.2kbp（DNA片段的平均长度应为0.5-2kbp）。如果DNA差或过分碎片，在步骤D2中调整超声处理的输出或循环
  
  图1.凝胶染色和DNA断裂的实施例 A.使用振荡器（染色染料）进行凝胶染色（速度：1圈/1-2秒）。 B.DNA断裂的实例。 M：DNA梯形标记。
制备与抗体缀合的Dynabeads（抗FLAG抗体或正常小鼠IgG）
1. 准备两个2毫升管;一个用于抗FLAG抗体，另一个用于正常小鼠IgG。在每个管中加入300μlDynabeads-Protein G（300μl×2管）。在该协议中，我们描述了用于通过质谱法分析的一个样品的制备。在这点上，在步骤G3中使用正常小鼠IgG用于预清除，在步骤G5中将抗FLAG抗体用于亲和纯化。如果您分析另一个样品作为阴性对照（例如使用正常小鼠IgG而不是抗FLAG抗体进行亲和纯化），您可以单独制备染色质和Dynabeads。
2. 将管放在磁力架上，等待3分钟。通过吸移弃上清。磁铁架的处理如图2所示。
  
  图2.在洗涤步骤中处理磁体架。 A.将Dynabeads悬浮在2ml管中。 B.在磁体座上设置管。 C.设置后3分钟。 D.通过移液除去上清液。
3. 将沉淀重悬于1ml PBS-T中。将管放在磁力架上，等待2分钟。通过移液除去上清液。
4. 重复步骤F3（总共两次）。
5. 将沉淀重悬于1.5ml PBS-T-BSA中。
6. 加入30μg抗体。一管用于30μg抗FLAG抗体，另一管用于30μg正常小鼠IgG。在4℃下旋转过夜。
7. 短暂离心（400×g/2-3秒）。将管放在磁力架上，等待3分钟。通过移液除去上清液。
8. 将沉淀重悬于1.5ml PBS-T中。倒置几次并短暂离心（400×g/2-3秒）。将管放在磁力架上，等待3分钟。弃去上清液移液。
9. 重复步骤F8，两次（总共三次）。 Dynabeads准备好下一步。
染色质免疫沉淀
1. 将1.6ml碎片染色质（其对应于从4×10 7个细胞提取的染色质）转移到2ml管中。
2. 加入400μl5％Triton X-100（在MLB3中）至1％终浓度
3. 将在步骤G2中制备的染色质溶液（2ml）加入试管中，其中制备与正常小鼠IgG缀合的Dynabeads。在4℃下旋转1小时。
4. 将管放在磁力架上，等待3分钟。
5. 将上清液转移到管中，其中制备与抗FLAG抗体缀合的Dynabeads。在4℃下旋转过夜。
6. 将管放在磁力架上，等待3分钟。通过移液除去上清液。
7. 洗涤1：加入1.8ml LSB。在4℃下旋转5分钟。将管放在磁力架上，等待3分钟。通过吸移弃上清。
8. 重复清洗1（总共两次）。
9. 洗涤2：如步骤G7中所述用HSB洗涤。重复此洗涤（共两次）。
10. 洗涤3：如步骤G7中所述用LiCl缓冲液洗涤。重复此洗涤（共两次）。
11. 加入1.8ml TBS-IGEPAL CA-630。在4℃下旋转5分钟。将管放在磁力架上，等待3分钟。通过移液除去上清液。
12. 洗脱：将沉淀重悬在200μl洗脱缓冲液中。在37℃孵育20分钟。将管放在磁力架上，等待3分钟。
13. 将上清液（200μl）加入1.5ml管中，加入0.5ml 2-丙醇，25μl3M乙酸钠缓冲液（pH5.2）和5μl20mg/ml糖原。在-20℃下沉淀蛋白过夜
14. 在4℃下以16,000×g离心30分钟。弃去上清液。
15. 用1ml 70％乙醇冲洗。在4℃下以16,000×g离心10分钟。通过移液完全弃去上清液。
16. 加入40μl的2x样品缓冲液。在最大设置下涡旋5分钟以完全溶解沉淀。在100℃孵育30分钟（蛋白质变性和逆交联）
SDS-PAGE，染色，质量分析
1. SDS-PAGE。在聚丙烯酰胺凝胶上运行洗脱液，直到染料从孔中达到1cm。
2. 考马斯亮蓝（CBB）染色或银染色。凝胶图像的一个例子如图3所示。
  
  图3. CBB染色后的凝胶图像的实例。原始图像显示在参考文献中的补充图5中（Fujita等人，2013）。
3. 将凝胶切成5片×2毫米。
4. 在凝胶消化和质量分析。您可以使用凝胶胰蛋白酶消化试剂盒。我们目前的质谱分析系统是一个nanoLC-MS/MS系统，由LTQ Orbitrap Velos与nanoLC和HTC-PAL自动进样器组成。

食谱

1.25M甘氨酸溶液（200ml）

甘氨酸（MW：75.07）
18.8克

H sub 2 O
到200ml
10％脱氧胆酸钠（10ml）

脱氧胆酸钠盐一水合物 1克

H sub 2 O
到10 ml
细胞裂解缓冲液（CLB）（40ml） 10mM Tris（pH 8.0），1mM EDTA，0.5％IGEPAL CA-630,1×蛋白酶抑制剂

1 M Tris（pH 8.0）
400μl

0.5 M EDTA
80μl

IGEPAL CA-630
200μl

完整，迷你，无EDTA 4粒

双蒸水（DDW）
39.32毫升

核裂解缓冲液（NLB）（40ml） 10mM Tris（pH8.0），1mM EDTA，0.5M NaCl，1％Triton X-100,0.5％脱氧胆酸钠，0.5％月桂酰肌氨酸，1×蛋白酶抑制剂

1 M Tris（pH 8.0）	400μl
0.5 M EDTA	80μl
5 M NaCl	4 ml
Triton X-100	400μl
10％脱氧胆酸钠	2 ml
30％月桂酰肌氨酸	666微升
完整，迷你，无EDTA	4粒
DDW	32.46 ml

改性裂解缓冲液3（MLB3）（10ml） 10mM Tris（pH8.0），1mM EDTA，0.5mM EGTA，150mM NaCl，0.1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1×蛋白酶抑制剂

1 M Tris（pH 8.0）	100微升
0.5 M EDTA	20微升
0.1 M EGTA	50微升
5 M NaCl	300微升
10％脱氧胆酸钠	100微升
10％SDS	100微升
完整，迷你，无EDTA	1个平板电脑
DDW	9.33 ml

10％吐温-20（10ml）

吐温-20
1 ml

DDW
9 ml
PBS-T（10ml） PBS（pH 7.4），0.01％Tween-20

PBS
10 ml

10％Tween-20
10微升
PBS-T-BSA（10ml） PBS（pH 7.4），0.01％Tween-20,0.1％BSA

PBS
10 ml

10％Tween-20
10微升

7.5％BSA馏分V/ 133微升
5％Triton X-100（在MLB3中）（5ml）

MLB3
4.75 ml

Triton X-100
250微升
低盐缓冲液（LSB）（10ml）
20mM Tris（pH 8.0），2mM EDTA，150mM NaCl，1％Triton X-100,0.1％SDS

1 M Tris（pH 8.0）
200μl

0.5 M EDTA
40微升

5 M NaCl
300微升

Triton X-100
100微升

10％SDS
100微升

DDW
9.26 ml
高盐缓冲液（HSB）（10ml） 20mM Tris（pH 8.0），2mM EDTA，500mM NaCl，1％Triton X-100,0.1％SDS

1 M Tris（pH 8.0）
200μl

0.5 M EDTA
40微升

5 M NaCl
1 ml

Triton X-100
100微升

10％SDS
100微升

DDW
8.56 ml
LiCl缓冲液（20ml） 10mM Tris（pH8.0），1mM EDTA，0.25M LiCl，0.5％IGEPAL CA-630,0.5％脱氧胆酸钠

1 M Tris（pH 8.0）
200μl

0.5 M EDTA
40微升

8 M LiCl
625μl

IGEPAL CA-630
100微升

10％脱氧胆酸钠 1 ml

DDW
18.035 ml
TBS-IGEPAL CA-630（10ml） 50mM Tris（pH7.5），150mM NaCl，0.1％IGEPAL CA-630

1 M Tris（pH 7.5）
500微升

5 M NaCl
300微升

IGEPAL CA-630
10微升

DDW
9.19毫升
洗脱缓冲液（500μl）
50mM Tris（pH7.5），150mM NaCl，0.1％IGEPAL CA-630,500μg/ml 3x FLAG肽

5mg/ml在TBS中的3x FLAG肽
50微升

TBS-IGEPAL CA-630
450微升
2x样品缓冲液（50ml）
125mM Tris（pH6.8），10％2-巯基乙醇，4％SDS，10％蔗糖，0.004％溴酚蓝

1 M Tris-HCl（pH 6.8）
6.25 ml

2-巯基乙醇 5 ml

...

1 M Tris-HCl（pH 6.8）
6.25 ml

2-巯基乙醇 5 ml

2 mg

DDW
to 50 ml

Acknowledgments

This protocol was adapted from the previously published paper (Fujita et al., 2013). We thank F. Kitaura for technical assistance. This work was supported by Research Institute for Microbial Diseases (T.F. and H.F.), Program for Combined Research Fields from Immunology Frontier Research Center, Osaka University (H.F.), the Takeda Science Foundation (H.F. and T.F.), the Asahi Glass Foundation (H.F.), A-STEP from Japan Science and Technology Agency (H.F.), Grant-in-Aid for Young Scientists (B) (#22710185) (T.F.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas ‘‘Cell Fate’’ (#23118516) (T.F.), ‘‘The Genofield’’ (#23114707) (H.F.), ‘‘Transcription Cycle’’ (25118512) (H.F.).

References

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Fujita, T. and Fujii, H. (2012). Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain. Advances Biosci Biotechnol 3(5): 626-629.
Fujita，T。和Fujii，H。（2013a）。有效分离特定基因组区域并通过工程化DNA结合分子介导的染色质免疫沉淀来鉴定相关蛋白（enChIP）使用CRISPR。 Biochem Biophys Res Commun 439（1）：132-136。
藤田，和富士，（2013b）。基因座特异性生化表观遗传学/通过插入染色质免疫沉淀的染色质生物化学。 ISRN Biochem 2013，文章编号913273.
Fujita，T.，Asano，Y.，Ohtsuka，J.，Takada，Y.，Saito，K.，Ohki，R.and Fujii，H。通过改造的DNA结合分子介导的染色质鉴定端粒相关分子immunocrecipitation（enChIP）。 Sci Rep 3：3171.
Hoshino，A。和Fujii，H。（2009）。插入染色质免疫沉淀：分离特异性基因组区域的方法 J Biosci Bioeng 108（5）：446-449。