材料和试剂

小鼠（4周-16周龄）
高级DMEM/F12（Life Technologies，Gibco ，目录号：12634-010）
热灭活的胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10500-064）
PBS（不含Ca 2+和Mg 2+）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14190-094）。
青霉素/链霉素（10,000单位/ml青霉素;10,000μg/ml链霉素）（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-22）
70％乙醇
100x GlutaMAX TM-I（Life Technologies，Gibco ，目录号：35050-038）
1 M HEPES（Life Technologies，Gibco ，目录号：15630-080）
50x B-27补充剂（Life Technologies，Gibco ，目录号：17504-044）
100x N-2补充剂（Life Technologies，Gibco ，目录号：17502-048）
BD Matrigel基底膜基质（10ml）（BD Biosciences，目录号：354234）
庆大霉素试剂溶液（50mg/ml）（Life Technologies，目录号：15750-060）
无菌0.1％BSA（在PBS中）
无菌2mM EDTA（见配方）
洗涤液（见配方）
N-乙酰基-L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A9165-5G）（参见配方）
重组鼠EGF（Pepro Tech，目录号：AF-315-09）（参见Recipes）
重组鼠头蛋白（Pepro Tech，目录号：250-38）（参见Recipes）
重组人类R-Spondin-1（Pepro Tech，目录号：120-38）（参见Recipes）

设备

镊子和短尖尖剪刀（例如 Hardened Fine Iris Scissors，Fine Science Tools，目录号：14090-09）
70μm细胞滤器（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352350）
离心机5702R（Eppendorf）
盖玻璃
显微镜
24-孔组织培养板（Sarstedt AG，目录号：83.1836）
培养皿
Falcon管（50ml，15ml）
移液管（20ml，10ml，1ml，100μl）
Pipetboy
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养

程序

第I部分。隔离
开始之前：把matrigel放在冰上，以解冻它注意：对于基质胶处理，请按照制造商的说明进行操作。

收获
1. 小肠是从小鼠收获的。
2. 将肠放置在含有冰冷的洗涤溶液的培养皿中，然后除去脂肪和相邻的组织。
  注意：在整个过程中，组织和洗涤液都应存放在冰上。
3. 肠纵向打开并用洗涤液从腔内容物中洗出
4. 使用盖玻璃刮除肠的绒毛。
  注意：从这一步，程序应在无菌条件下继续。为了安全起见，建议在肠道两侧进行刮擦。分离的绒毛被视为多云的解决方案。
5. 用洗涤液洗涤肠，然后用尖点剪刀切成2-4mm片
6. 将材料转移到含有10-20ml洗涤溶液的50ml falcon管中注意：组织碎片可能粘在移液器上。为避免这种情况，建议预先润湿移液器。
7. 将材料用10ml移液管上下移动几次。
8. 在组织碎片沉降后，除去上清液
洗涤
1. 对于洗涤，加入10-20ml洗涤溶液。然后，沉淀组织碎片。之后，除去上清液。
2. 重复步骤B1直到上清液澄清（约10次）
3. 向组织碎片中加入25ml 2mM EDTA
4. 将含有组织碎片和EDTA的猎鹰管置于振荡器上并在4℃下孵育15分钟。
5. 将组织碎片沉淀，然后除去上清液
6. 加入10-20ml洗涤溶液。然后，沉淀组织碎片。之后，除去上清液。
7. 将洗涤溶液加入到组织碎片中，向上和向下吸移3-5次，并通过70μm细胞过滤器。
8. 流出物（I馏分）储存在冰上，并在洗脱的步骤C3中进一步进行注意：隐窝存在于上清液中，通过细胞滤网的孔，而组织碎片留在细胞滤网的顶部。
9. 向组织碎片中加入25ml 2mM EDTA
10. 将含有组织碎片和EDTA的猎鹰管置于振荡器上并在4℃下孵育15分钟。
11. 将组织碎片沉淀，然后除去上清液
12. 加入10-20ml洗涤溶液。然后，沉淀组织碎片。之后，除去上清液。
13. 将洗涤溶液加入到组织碎片中，向上和向下吸移3-5次，并通过70μm细胞过滤器。
14. 流出物（I馏分）储存在冰上，并在洗脱的步骤C3中进一步进行注意：隐窝存在于上清液中，通过细胞滤网的孔，而组织碎片留在细胞滤网的顶部。
  ...
15. Washing solution is added to the tissue fragments, gently pipetted up and down 3-5 times and passed through a 70 µm cell strainer (II fraction).
  Note: This step is repeated; as a result fraction III will be collected (optional). Tissue fragments might stick to the pipette. To avoid that, pre-wetting of the pipette is recommended.
16. Crypts from certain fractions are observed under the microscope. Presence of finger-like structures (= crypts, see Figure 1) indicates a successful isolation.
  
  Figure 1. A representative of a freshly isolated crypt. Objective 10x, scale bar 100 µm
17. Crypts are spin down at 600 rpm for 5 min at 4 °C to remove single cells. A 24-well plate is pre-warmed by placing it into the cell culture incubator.
18. After centrifugation the supernatant is discarded.
  Note: If the pellet is not visible, the centrifugation should be repeated.
19. The pellet is resuspended in 10 ml of ice-cold Basal Medium 2 (BM2; see Table 1). Crypts are counted under the microscope.
  
  Table 1. Composition of BM2 (50 ml)
  
  Component
  Volume
  
  50x B27
  
  100x N2
  
  N-乙酰基-L-半胱氨酸（500mM）
  
  1ml
  
  0.5ml
  
  125μl
  
  BM1（见表2）
  至最终体积为50ml
  
  储存在4°C或-20°C（避免反复冻融循环）
20. 将隐窝在4℃下以800rpm离心5分钟。
21. 将冻结颗粒重悬在基质胶中：
  1. 每50μl基质胶使用100-500个隐窝
  2. 轻轻吸取，避免气泡
22. 将50μl基质胶每孔移入预热的24孔板中，然后将板在室温下放置2-3分钟。
  注意：移取基质胶恰好在孔中间，因此形成基质胶滴（见图2）。
  
  图2.器官培养方案
23. 将板转移到细胞培养孵育器中并在37℃孵育5-10分钟（直到基质胶完全凝固）。
24. 每孔加入0.5ml隐窝培养基（CCM;参见表3）
25. 将板转移回细胞培养孵化器

第二部分。文化

每周2-3次除去培养基，加入0.5ml /孔的新鲜培养基（CCM，参见表3）。当类器官大（见图3C），他们应该通过。通常每周进行一次。机体应以1：4的比例分裂

图3.分别在3D培养物中的分离的小肠隐窝，A，B，C-48h/5天/12天。 A和B，通道O.C，通道1.相差，物镜10x，比例尺100μm
通行程序：

中等已删除。
加入0.5ml冰冷的Basal培养基1（见表1）
将板在冰上孵育至少5分钟注意：从这个步骤开始，类固醇将一直保持在冰上。
用移液管吸取上清液和下清液几次（使用1ml移液管）。
将所有类器官转移至一个冰冷的15ml falcon管中，并用基础培养基1（BM1;参见表2）填充至最终体积为15ml。

表2. BM1（500ml）的组成

组件
卷

高级DMEM/F12

100x GlutaMax

100x Pen/Strep

Hepes（1M）

485ml

5毫升

5毫升

5毫升

储存在4°C
将组织在4℃下以600rpm离心5分钟。在离心过程中，24孔板在37℃预热
小心除去上清液。
注意：去除尽可能多的上清液。小心不要去除类器官。
将10ml冰冷的BM1加入到有机物小丸中
将类器官在4℃下以800rpm离心5分钟
小心地除去上清液。
注意：在这个步骤中，应该可以看到好的颗粒，上清液应该完全去除。
将类固醇与基质胶混合并用移液管上下移动注意：在移液期间避免气泡。使用4倍体积的第一次使用的基质胶。
将50μl基质胶/孔移入预热的24孔板中注意：移液器正好在孔中间，这样就形成了基质胶滴。
将板在室温下放置2-3分钟。
将板转移到细胞培养孵育器中并在37℃孵育5-10分钟（直到基质胶完全凝固）。
每孔加入0.5ml CCM（参见表3）
将板转移回细胞培养孵化器
表3.CCM（20ml）的组成

组件
卷

BM2

EGF（50ng /μl）

头蛋白（100ng /μl）

R-Spondin-1 （1 μ g /μl）

20毫升

10μl

20μl

10μl

短期储存在4°C或-20°C（避免反复冻融循环）

笔记

培养物中活隐窝的百分比为约90-95％。隐窝生存力在体外严重依赖于用于制备培养基的生长因子的质量。此外，培养基应该是新鲜制备的（并且在4℃下储存至多5天），或者应当制备单次使用的等分试样并在-20℃下储存一个月。
活的和健康的器官培养的特征在于芽的存在和随时间的器官大小的增加。刚刚通过后，类器官很小，但是然后他们再次成长为如图3C所示的结构。地穴培养物包含肠干细胞，其代表多能干细胞群体，因为它们具有仅分化成肠上皮细胞的潜力。存在某些类型的肠上皮细胞，并且它们可以通过染色鉴定：干细胞（例如，Lgr5染色），杯状细胞（例如，高碘酸 - 希夫染色），Paneth细胞（例如溶菌酶染色），肠细胞（例如肠碱性磷酸酶染色），肠内分泌细胞（例如嗜铬粒蛋白A染色）（Sato et al。，2009）。一些其它可能的染色是：β-连环蛋白（活性Wnt信号传导）和Ki-67（增殖标记）。

食谱

2mM EDTA 500 ml PBS
2.5ml 0.5M EDTA（pH 8）的蒸馏水（无菌过滤）储存在4°C
洗涤溶液
50ml FBS
450 ml PBS
0.5 ml庆大霉素，原液50 mg/ml（可选）
储存在4°C
500mM N-乙酰基-L-半胱氨酸将407.5mg N-乙酰基-L-半胱氨酸溶于5ml蒸馏水中
无菌过滤器
制作报表
储存在4°C
EGF，头蛋白，R- Spondin-1 根据制造商说明书制备储备溶液（EGF 50 ng /μl;头蛋白100 ng /μl; R-Spondin 1μg/μl）
示例：
头蛋白100ng /μl
加入1ml的0.1％BSA（在PBS中）到具有100μgNoggin的小瓶中通过吹打混合
制作等份
储存于-20°C

致谢

该方案从Sato et al。（2009）。

参考文献

Sato，T.，Vries，RG，Snippert，HJ，van de Wetering，M.，Barker，N.，Stange，DE，van Es，JH，Abo，A.，Kujala，P.，Peters，PJand Clevers， H.（2009）。单个Lgr5干细胞体外构建隐窝 - 绒毛结构，无间质利基。自然 459（7244）：262-265。