材料和试剂

花在不同发育阶段的拟南芥花序
JC-1染料（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：T3168）
DMSO 99.9％（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
储备溶液（10mg/ml的JC-1的DMSO溶液）
工作溶液（10μg/ml的JC-1在缓冲液A中）
缓冲液A（20mM HEPES缓冲液，pH7.2）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）（参见配方）

设备

共聚焦显微镜（Nikon Eclipse C1 Plus共焦显微镜，使用EZ-C1 3.80成像软件和Ti-Control）
解剖显微镜（尼康公司，型号：SMZ800）
盖片（18 x 18毫米）
显微镜载玻片（26×76mm）
1ml胰岛素注射器和0.3×13mm针头（BD）
针尖镊子

软件

用于Windows的NIH ImageJ软件1.47（ http://rsb.info.nih.gov/ij/）

程序

雌蕊隔离（图1，A-E）使用一对镊子，在不同发育阶段从拟南芥花序中获取花（Alvarez-Buylla等人，2010）。在显微镜载玻片上和在解剖显微镜下，使用两个1ml胰岛素注射器（0.3×13mm）的针去除萼片，花瓣，花药和柱头，并在隔膜的每一侧的雌蕊上进行纵向浅表切口（图1）。
雌蕊染色（图1，F-G）。
1. 将雌蕊浸在100μl含有10μg/ml JC-1的缓冲液A溶液中。
2. 在室温下孵育30分钟，无振荡。避光，因为染料是光敏的。
3. 用缓冲液A轻轻洗涤雌蕊三次。
显微镜的样品制备（图1，H-L）。
1. 在解剖显微镜下的显微镜下，使用的针两个1ml胰岛素注射器（0.3×13mm）以解剖露出的雌蕊胚珠
2. 添加一滴缓冲液A，并用盖玻片覆盖样品
3. 立即在共聚焦显微镜下观察。强度绿色（激发/发射波长= 485/538nm）和红色（激发/发射波长= 485/590nm）
  
  图1.示意图显示胚囊线粒体染色所需的步骤
图片分析（ Power Point 1 ）。使用NIH ImageJ软件计算JC-1图像的红色与绿色荧光的比率。
1. 每个胚囊的轮廓使用徒手工具分隔创建感兴趣区域（ROI）并使用ROI管理器工具保存（分析>工具> ROI经理>添加）。
2. 在"分析"菜单中，选择"设置测量"，然后单击区域和"平均灰度值"
3. 使用图像菜单，选择"颜色"，然后选择"拆分频道"
4. 关闭蓝色通道中的图像。在绿色通道上，转到分析>工具> ROI经理并选择之前添加的ROI。投资回报率将出现在图像上。仍然在ROI经理去更多>多测量。结果将显示在新窗口中。
5. 对红色通道中的图像重复此步骤。
6. 复制结果并将其粘贴到excel工作表中。
7. 计算每个ROI的红色到绿色荧光比率。

食谱

缓冲区A
20mM HEPES缓冲液（pH7.2）对于1升1 M HEPES缓冲液：
将238.3g HEPES（游离酸）溶解在500ml ddH 2 O中。
搅拌，同时用0.5N NaOH调节pH7.2 用ddH 2 O将体积调至1L，以制备1L的20mM HEPES缓冲液（缓冲液A）
在980ml ddH 2 O中加入20ml 1M HEPES缓冲液

致谢

该方案改编自Hauser等人（2006）。这项工作得到霍华德休斯医学院（HHMI），国家科学技术研究委员会（CONICET），国家科学技术促进局（AGENCIA）和马德普拉塔国立大学（UNMdP）的支持。我们感谢生物协议编辑委员会友好地邀请我们编写这个协议。

参考文献

Alvarez-Buylla，ER，Benitez，M.，Corvera-Poire，A.，Chaos Cador，A.，de Folter，S.，Gamboa de Buen，A.，Garay-Arroyo，A.，Garcia-Ponce，，Jaimes-Miranda，F.，Perez-Ruiz，RV，Pineyro-Nelson，A.and Sanchez-Corrales，YE（2010）。花卉开发。拟南芥书 8：e0127。
Hauser，B.A.，Sun，K.，Oppenheimer，D.G。和Sage，T.L。（2006）。线粒体膜电位的变化和活性氧簇的积累先于胚珠流产期间的超微结构变化。 223（3）：492-499
Martin，M.V.，Fiol，D.F.，Sundaresan，V.，Zabaleta，E.J.and Pagnussat，G.C。（2013）。 oiwa，一种线粒体锰超氧化物歧化酶中受损的女性配子体突变，揭示了活性氧的关键作用植物细胞 25（5）：1573-1591。