材料和试剂

设备

程序

单元格和媒体
将HEK-Blue TM sup/TM IFN-α/β细胞维持在含有10％热灭活的FCS，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素和100μg/ml Normocin的DMEM中的加湿在37℃，5％CO 2培养箱中。 HEK-Blue ^TM IFN-α/β细胞不应传代超过20次以保持完全有效。应该用两种选择性抗生素Zeocin（100mg/ml）和杀稻瘟素（30μg/ml）维持HEK-Blue TM sup/TM IFN /α/β细胞。在测试过程中不要使用选择性抗生素。当达到70-80％汇合时，应传代细胞。

干扰素检测
第1天

每孔加入50μl平底96孔板的每个样品。如果感染性病毒存在于所收集的样品中，则应该使用UV交联剂在1,000μJ/cm 2下将其灭活5分钟。 96孔板的样品用标准品，样品和阴性对照（详见后续步骤）。 "模拟"表示相同量的培养基，但来自未感染的细胞。 "Negc.c."表示阴性对照，如下所述

加入50μlIFN-α或IFN-β稀释液（1-8）。

转移25微升到每个下一个井，使1：3稀释，如上表所示。为了制备稀释液，使用与用于维持HEK-Blue ^TM IFN-α/β细胞（此步骤不需要选择性抗生素）相同的DMEM。

建议的阴性对照：（1）50μl在10 4 U/ml的IFN-γ在一个孔中，（2）50μl来自病毒感染的IFN-α/β-阴性的UV-灭活培养基细胞系（如BHK-21），其具有与在相同实验中使用的样品相似的病毒滴度
在测试培养基（含有10％热灭活的FCS，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素的DMEM）中制备HEK-Blue TM IFN-α/β细胞以约280,000个细胞/，和100μg/ml诺莫菌素）
每孔加入180μl细胞悬浮液（〜50,000个细胞）
将板在CO 2培养箱中在37℃下孵育20-24小时。

第2天

按照包装上的说明准备QUANTI-Blue ^TM试剂
向平底96孔板的每孔中加入180μl重悬的QUANTI-Blue TM sup试剂。
加入50μl来自诱导的HEK-Blue ^TM IFN-α/β细胞的上清液
在37℃下在CO 2培养箱中孵育平板1-3小时
使用分光光度计（Tecan Sunrise读板器）在620-655nm测定SEAP水平
应使用对于所获得的值的每个范围单独绘制的绘图进行计算。请注意，曲线不是线性的，IFN值应在检测范围内，否则使用初始样品的稀释液在一个实验中获得的代表性曲线如下所示。请注意，在给定的实验条件下，高浓度的IFN（1,000-10,000）达到平台水平，强烈建议稀释初始样品：

注意：制造商建议使用20μl样品体积（第1天）和20μl上清液（第2天），但是我们发现增加体积（50μl）提高了结果的重现性。

笔记

所有具体的产品信息和指南可以在制造商的网站上找到：
http://www.invivogen.com/hek-blue-ifn-ab.
细胞系稳定性
在早期阶段准备足够数量的冷冻储备物是至关重要的。 HEK-Blue ^TM IFN-α/β细胞不应传代超过20次以保持完全有效。 HEK-Blue TM/IFN-α/β细胞应保持在补充有两种选择性抗生素Zeocin TM（100mg/ml）和杀稻瘟素（30μg）的生长培养基中/ml）。需要使用杀稻瘟素的抗生素压力来维持编码人STAT2和IRF9基因的质粒，并且需要Zeocin ^TM来维持编码SEAP的质粒。

致谢

该协议发表在Lulla等人的原始论文中。（2013）。这项工作得到爱沙尼亚科学基金会拨款7501,7407和9421的支持;目标融资项目SF0180087s08;和欧洲联盟通过欧洲区域发展基金通过化学生物学卓越中心。

参考文献

Lulla，V.，Karo-Astover，L.，Rausalu，K.，Merits，A.and Lulla，A.（2013）。演示文稿覆盖了特异性：通过突变分析探测甲病毒蛋白水解活性的可塑性。 J Virol 87（18）：10207-10220。
Randall，R.E.and Goodbourn，S。（2008）。干扰素和病毒：诱导，信号传导，抗病毒反应和病毒对策之间的相互作用。 J Gen Virol 89（Pt 1）：1-47。