材料和试剂

Huh7人肝癌细胞，稳定复制wt JFH1亚基因组复制子（NS4B wt）和在NS4B（NS4B ）中携带HA表位和适应性突变Q31R的重组复制子细胞系，）（Paul等人，2013）和稳定过表达C末端HA标记的钙联接蛋白（CANX HA ）的Huh7肝癌细胞（Paul等人， em>，2013）
100 U/ml青霉素和链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140122）
10％（v/v）胎牛血清（Life Technologies，Gibco ，目录号：10270-106）
1x非必需氨基酸（Life Technologies，目录号：11140-035）
遗传霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：11811-098）
杀稻瘟素（Life Technologies，Gibco ，目录号：R210-01）
Bradford试剂
NaN 3（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）
血凝素肽（Sigma-Aldrich，目录号：I2149）
抗HA琼脂糖珠（Sigma-Aldrich，目录号：A2095）
1x蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：04693116001）
Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：41965-039）（参见Recipes）
牛血清白蛋白（BSA）标准（见Recipes）
PBS（无菌）（参见配方）
低渗缓冲液（见配方）
蔗糖（参见食谱）
5 M NaCl溶液（见配方）
IP洗涤缓冲液I（参见配方）
IP洗涤缓冲液II（参见配方）
IP洗脱缓冲液（参见配方）

设备

15厘米细胞培养皿
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
细胞刮刀（ SARSTEDT AG，目录号：83.1830）
Dounce匀浆器（1ml）（例如WHEATON，目录号：357538）
具有用于15ml和50ml falcon管（例如Heraeus Multifuge 3-SR）的摆动桶的台式冷却离心机。
用于SW40转子的敞口超清洁超离心管（Seton Identification Products，目录号：7031）
超速离心机和SW40转子和桶（例如Beckman Optima LE80K超速离心机和Beckman SW40Ti转子和桶）
实验室支架和夹具
19 G针（例如BD，目录号：301500）
分光光度计（例如Amersham Ultrospec 2100pro）和比色皿（例如SARSTEDT AG，目录号：67.742）
用于Eppendorf管的旋转轮（例如，Labinco，型号：L28，目录号：2800）
用于Eppendorf反应管（例如Eppendorf，型号：5417R）的台式冷却离心机
Eppendorf Thermomixer紧凑型

程序

在37℃，5％CO 2亚环境中，在复制子细胞系的情况下，在0.5mg/ml遗传霉素存在下，在培养箱中的DMEM cplt中培养细胞， 10μg/ml杀稻瘟菌素用于CANX过表达细胞。实验需要约5-7.5×10 7个细胞，其等于六个15cm细胞培养皿。
注意：收获当天细胞汇合不应超过90％。
将细胞在PBS中洗涤两次，随后在每个培养皿中刮5ml PBS，并转移到50ml falcon管中。
细胞在4℃下以700×g离心10分钟
除去上清液，将细胞重悬浮于含有1×蛋白酶抑制剂混合物的2ml低渗缓冲液中
将细胞在冰上孵育30分钟
用dounce匀浆器通过40次冲击破碎细胞。
注意：在每个行程中将砂浆室底部的杵转动90°。
通过在4℃下以700×g离心10分钟使细胞碎片和细胞核沉淀。
在超离心SW40管中制备不连续蔗糖梯度：
吸取4毫升70％蔗糖在底部，并连续小心地与3毫升60％蔗糖，2毫升40％蔗糖和2毫升30％蔗糖重叠。
将2ml后核上清液（参见步骤7）小心地铺在蔗糖梯度的顶部
通过使用SW40转子在130,000×g下超速离心4小时，在蔗糖梯度中分离膜级分。
将管放置在实验室支架的夹子中，并使用19 G针在底部小心地做一个洞。收集13个1ml级分，其中级分数1是最低的，数字13表示梯度的顶部。
注意：渐变的洗脱速度应该是每秒1滴左右，这可以通过底部的孔尺寸进行调整。
可以分析梯度级分的蛋白质和HCV RNA含量。通常，大部分HCV RNA和蛋白质存在于级分7-11（Paul等人，2013）中，因此随后汇集。
通过加入合适体积的5M NaCl溶液（例如150μl5M NaCl，5ml级分7-11）将合并的级分7-11平衡至150mM NaCl，并储存少量等分试样（〜 50μl作为输入样品）。
使用Bradford测定法和BSA标准曲线确定合并级分中的蛋白质浓度
用500μlIP洗涤缓冲液I在2ml Eppendorf管（对于每种NS4B ，NS4B 和CANX ）中洗涤25μl抗HA琼脂糖珠， sup>）。通过在4℃下以3,800×g离心3分钟沉淀颗粒珠并除去上清液。
在4℃下在旋转轮上孵育含有总共约1mg蛋白质（约1-1.5ml）的膜部分的珠子4小时。
注意：三个IP样品的总蛋白输入应相同。
通过在4℃下以3,800×g离心3分钟来沉淀小珠和结合材料，并除去上清液。
用1ml IP洗涤缓冲液I洗涤珠子三次，并在每个洗涤步骤之间，如步骤17所述，颗粒珠子
加入1ml IP洗涤缓冲液I，并将珠子和结合材料转移到新的eppendorf管和颗粒珠子，如步骤17所述。
用1ml IP洗涤缓冲液II和颗粒珠洗涤珠子，如步骤17所述
结合物质的洗脱：
1. 向珠子中加入100μlIP洗脱缓冲液，并在25℃下以1,100rpm将样品摇动15分钟
2. 通过在25℃下以3,800×g离心3分钟来沉淀颗粒珠
3. 收集并保留上清液。
4. 向珠子中加入100μlIP洗脱缓冲液，并在25℃下以1,100rpm将样品摇动15分钟
5. 通过在25℃下以3,800×g离心3分钟来沉淀颗粒珠
6. 收集并与来自步骤21c的上清液混合。
IP洗脱级分可以在多种后续测定中进行分析，包括蛋白质印迹，RNA定量以及电子显微镜分析（Paul等人，2013）。

食谱

完全Dulbecco's改良的Eagle培养基（DMEM subpl） 2mM L-谷氨酰胺 1x非必需氨基酸
补充100U/ml青霉素和链霉素 10％（v/v）胎牛血清（在56℃热灭活30分钟）
BSA标准
将0.1g BSA溶于10ml IP洗涤缓冲液I（终浓度10μg/μl）中在Bradford测定中使用BSA标准品的1，2，3和4μl。
PBS
8mM Na 2 HPO 4
2mM NaH 2 PO 4>/
140mM NaCl 0.27mM KCl
0.176mM KH 2 PO 4 sub/
低渗缓冲液
10mM Tris（pH8）
1.5mM MgCl 2 v/v 10 mM NaAc
蔗糖
70％将70g蔗糖溶解在100ml低渗缓冲液中 60％将60g蔗糖溶于100ml低渗缓冲液中 40％将40g蔗糖溶解在100ml低渗缓冲液中 30％将30g蔗糖溶于100ml低渗缓冲液中
5 M NaCl溶液
将1,461g NaCl溶于500ml水中
IP洗涤缓冲液I
含有40％蔗糖和150mM NaCl的低渗缓冲液
IP洗涤缓冲液II 含有10％蔗糖和150mM NaCl的低渗缓冲液
IP洗脱缓冲液
含有250μg/ml血凝素肽和0.01％NaN 3的IP洗涤缓冲液II

致谢

这里描述的协议已经在Paul等人的（2013）中以简短的形式出版。研究得到DFG TRR83 TP13的支持。

参考文献

Paul，D.，Hoppe，S.，Saher，G.，Krijnse-Locker，J.and Bartenschlager，R.（2013）。膜性丙型肝炎病毒复制区的形态学和生物化学特征。 Virol 87（19）：10612-10627。